Изменение уровня и активности антиоксидантных и прооксидантных металлопротеинов тканей крыс под влиянием L-аргинина (Теоретическая и профилактическая медицина)

Ключевые слова: металлопротеины, ткань, L-аргинин

В биологических системах нитроксильный радикал (NO.) образуется нитритоксидсинтазой (НОС) из гуанидиновой группы L-аргинина. NO pеагирует с активными формами кислорода (АФК) различного характера и с переходными металлами.  Взаимодействуя с супероксидными радикалами (О₂^–), NO oбразует пероксинитрильный радикал (–ОNOO), который далее превращается в NO2 и гидроксильный радикал (НО.). Этим NO. оказывает двойственный эффект: стимулирует липидную пероксидацию биомембран, оказывая прооксидантный эффект и нейтрализует О₂^–, оказывая антиоксидантный эффект. L-аргинин в отличие от D-аргинина увеличивает уровень более токсичного для биосистем.

–ОNOО путем повышения уровня NO. Взаимодействия  NO in vitro и in vivo существенно отличаются [5]. L-Аргинин и D-аргинин нейтрализуют О₂^–, продуцируемые в системе ксантин-ксантиноксидазы, ингибируют процесс прилипания фагоцитов и их АФК-продуцирующий потенциал in vitro. Этим L-аргинин оказывает антиоксидантный эффект [7]. Xронически вводимый диетический L-аргинин (2,5%) существенно подавляет продуцирование АФК и перекисного окисления липидов (ПОЛ), повышает уровень сывороточных нитритов у обезьян с гиперхолестеринемией [6]. Гидрохлорид L-аргинина (120мг/100г массы крыс), вводимый внутрибрюшинно, повышает мембранную текучесть и снижает ПОЛ в эритроцитарных мембранах (ЭМ) при гипоксии крыс на фоне увеличения активности супероксиддисмутазы (СОД) (64%) и каталазы (46%) [9]. L-аргинин вызывает антиоксидантный и кардиопротективный эффект на изолированное перфузируемое сердце крыс [12].

Физиологическая доза нитроксила в крови составляет 10^-7М, однако при воспалительных процессах уровень этого радикала повышается до 10^-6М и выше. При инкубации крови с 10^-7М NO наблюдается процесс усиления деформации эритроцитов. 10^-5М NO снижает текучесть липидов, 10^-3М NO вызывает повышение концентрации метгемоглобина и усиление деформации эритроцитов [8]. С другой стороны, ЭМ высокопроницаемы для NO и участвуют в процессе утилизации этих радикалов. 

Однако до сих пор комплексно не определены молекулярно-биохимические механизмы воздействия L-аргинина на уровень и активность ключевых металлопротеинов (МП) – регуляторов метаболизма АФК.

Цель работы – определить характерные количественные и качественные изменения металлопротеинов антиоксидантной активности – МАА (Cu,Zn-CОД, Мn-СОД, каталаза, церулоплазмин и трансферрин) и металлопротеинов прооксидантной активности – МПА (новые изоформы цитохрома (цит) b558 крови и других тканей, а также супероксидпродуцирующий липопротеин сыворотки крови) после инкубирования в аэробных условиях L-аргинина с этими МП in vitro и с гомогенатами тканей ex vivo. 

 Материал и методы

В опытах in vitro определенные количества лиофилизованных препаратов МАА и МПА былы инкубированы с 20мг/мл L-аргинином фирмы «Ликвор» в аэробных  условиях при 4^о в течение 48 ч. Были использованы следующие препараты МАА: Cu,Zn-СОД – по 5 мг, церулоплазмин – по 20 мг, трансферрин – по 20 мг и каталаза – по 10 мг (эти белки имели электрофоретически гомогенное состояние). Из МПА были использованы электрофоретически гомогенные препараты изоформ сывороточных цит b558I и цит b558II, цит b558III, из эритроцитарных мембран (ЭМ) и цит b5 из цитозоля эритроцитов. Супрол и изоформы цит b558 из мембран клеток селезенки (МКС) и мембран клеток печени (МКП) имели 92-95% чистоты. Эти белки были получены биотехнологическим (препаративным) способом [3], без использования детергента, который снижает стабильность цит b558 [4]. Белки были растворены в 3 мл 0,04М калий-фосфатном буфере (КФБ), рН=7,4. В контрольных опытах МАА и МПА инкубировали в аналогичных условиях в отсутствие L-аргинина. 

В опытах ex vivo 20мг/мл L-аргинина инкубировали с гомогенатами селезенки и печени, а также с кровью крыс в аэробных условиях при 4oС в течение 5 дней. В контрольных опытах инкубирование гомогенатов осуществляли в аналогичном режиме в отсутствие L-аргинина. Гомогенизацию селезенки и печени проводили на лабораторном гомогенизаторе со скоростью вращения ножей 2000 оборотов в мин в течение 2 мин в 30 и 50мл 0,04М КФБ при 4^oС соответственно. При этом были использованы ткани печени (по 20г) и селезенки (по 10г), которые подверглись перфузии физиологическим раствором. После инкубирования гомогенатов тканей и крови с L-аргинином осуществляли одновременное и комплексное получение МАА и МПА из этих объектов. Растворимые белковые фракции сыворотки, цитозоля эритроцитов, клеток селезенки и печени, а также белковые фракции МКС и МКП после их солюбилизации при рН 9 и выше [10] и после диализа против воды (используется только дистилированная вода) и центрифугирования подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозах ДЕ-52, КМ-52 («Whatman», Англия) и сефадексе ДЕАЕ А-50 («Pharmacia», Швеция) и гель-фильтрации на сефадексе G-150 («Pharmacia»). Часть ЭМ, МКС, МКП (5мл) отделяли для определения активности цит b558 в гетерогенной фазе. Изоформы цит b558 МКС и МКП в отличие от  цит b558 ЭМ имеют нейтральный характер, но по оптико-спектральным и другим показателям и активностям являются новыми изоформами, обладающими НАДРН-зависимой супероксидпродуцирующей и метгемоглобин (метНb)-восстанавливающей активностью [10]. Taким образом, были получены следующие МАА – Cu,Zn-СОД и каталаза из цитозоля эритроцитов, церулоплазмин и трансферрин – из сыворотки крови и следующие МПA – 2 новыe изоформы цит b558 из сыворотки крови и цитb558III из ЭМ, цит b558 из МКС и МКП, супероксидпродуцирующий липопротеин сыворотки – супрол, а также цит b5 из цитозоля эритроцитов. 

Количество МП определяли оптическим спектральным методом, путем измерения плотности характерного максимального оптического поглощения для цит b5 при 525нм, изоформ  цит b558 – 530нм,  супрола – 430нм, церулоплазмина – 610нм и трансферрина – 470нм. СОД-активность и О_2^–продуцирующую активность супрола и изоформ цит b558 ЭМ, сыворотки, МКС и МКП в гомогенной и гетерогенной  фазах определяли нитротетразолиевым синим (НТС) путем вычисления процента ингибирования (в случае СОД) или стимулирования образования формазана (при 560 нм), в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу СОД активности или О_2^–продуцирующей активности принимали количество белка, которое соответственно подавляет или стимулирует образование формазана на 50%. Супероксидпродуцирующую активность супрола и изоформ цит b558 определяли и методом восстановления цит С (последний получали из митохондрий сердца крыс до электрофоретически гомогенного состояния биотехнологическим способом путем ионообменной хроматографии фракции цит С на целлюлозе КМ-52, гель-фильтрации на сефадексе   G-25).

МетHb-восстанавливающую активность новых изоформ цит b558 из ЭМ, МКС и МКП [11] в гомогенной фазе определяли, используя свежеполученный метHb (ферриHb) крови крыс с величиной плотности максимального оптического поглощения альфа-полосы (при 565нм) 0,8. При этом величина плотности максимального оптического поглощения бета-полосы цит b558III в реакционной смеси составляла 0,03. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра к 3мл раствора метHb добавляли 0,2мл цит b558III (при А₅₃₀ = 0,45). После быстрого перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16ч при 30⁰С. После повторного перемешивания смеси определяли кинетику восстановления ферриHb до ферроHb путем измерения снижения плотности альфа-поглощения ферриHb (это снижение прямо пропорционально образовавшемуся ферроHb, который имеет поглощение при 555нм). Для определения метHb-восстанавливающей активности цит b558 в гетерогенной фазе (в ЭМ, МКС, МКП) к ферриHb добавляли 0,2мл ЭМ, МКС и МКП  смешивали с 0,04М КФБ. За единицу метНb-активности принимали количество цит b558, снижающее плотность оптического поглощения альфа-полосы метНb до 0,1 за 1ч при 30 ⁰С.

Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим титрованием раствора перекиси водорода в присутствии и отсутствие каталазы. За единицу каталазной активности принимали то количество фракции (белка), которое расщепляет 0,1М перекиси водорода в течение 1 мин при 20 ⁰С. 

Для определения цит С-восстанавливающей активности супрола и изоформ цит b558 к 4мл раствора цит С (при А₅₂₀ = 0,2) добавляли по 0,4мл этих белков с плотностью оптического поглощения 0,3 при 430нм для супрола и при 530нм для изоформ цит b558.Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре «Specord М-40» (Германия) с длиной оптического пути 1см при 20⁰С. 

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера, с определением критерия достоверности Р.

Результаты и обсуждение

Направленность изменений уровня и активности МАА под влиянием L-aргинина сохраняется in vitro и ex vivo (таблица, а). При этом наблюдается некоторое снижение уровня церулоплазмина ex vivo, но in vitro L-aргинин не вызывает изменения уровня этого металлопротеина–белка острой фазы [1]. Количество трансферрина в опытах in vitro снижено больше, чем в опытах ex vivo. Не исключается, что L-aргинин может улавливать ионы железа у голотрансферрина и снижать его поглощение при 470нм. L-аргинин не изменяет активность изоформ супероксиддисмутазы (Cu, Zn-СОД и Mn-СОД) из цитозоля эритроцитов, клеток селезенки и печени. Однако L-aргинин вызывает резкое повышение активности каталазы из цитозоля эритроцитов, цитозоля селезенки и печени. Механизм такого действия L-aргининa пока трудно интерпретировать. Этим может быть обусловлен антиоксидантный эффект L-aргинина [6,9,12]. Активирование каталазы L-аргинином является важным фактором защиты биосистем от повреждающих эффектов перекиси водорода, в первую очередь от продукта его расщепления гидроксильного радикала – самого сильного окислителя для биосистем. Такой эффект L-аргинина существеннее при воздействии с каталазой селезенки и особенно печени (таблица, а). Используемая доза L-аргинина подобрана на том основании, что в этих условиях низкие дозы L-aргинина мало эффективны. Повышение этих доз (20-25 мг/мл) в большинстве приводит к понижению pH среды (к тому же эти дозы не физиологические).

Уровень же МПА под влиянием L-аргинина изменяется по-разному (таблица, б). Если in vitro L-аргинин не вызывает изменения уровня изоформ цит b558 крови, то уровень изоформ цит b558 МКС и МКП существенно снижен. Возможно, что это связано с повышением степени агрегации этих гемопротеинов в МКС и МКП, под влиянием L-аргинина. Под влиянием L-аргинина процесс агрегации этих цитохромов МКС и МКП (они имеют изоэлектрическую точку 7), видимо, больше, чем таковой у цит b558III ЭМ (последний является белком кислого характера с изоэлектрической точкой 5,3). Можно предположить, что in vitro L-аргинин не вызывает нарушения микроструктуры ЭМ, гемопротеиновым компонентом которого является и цит b558III, но существенно изменяет микроструктуру МКС и МКП, что нельзя считать положительным эффектом L-аргинина (агрегация изоформ цит b558 препятствует процессу их солюбилизации). В опытах in vitro L-аргинин не влияет на уровень (оптико-спектральные характеристики) цит С из митохондрий клеток селезенки и печени. 

В опытах ex vivo направленность этих изменений несколько отличается. Hа фоне повышения уровня цит b5 цитозоля эритроцитов, цит b558III ЭМ, супрола и цит С наблюдается снижение уровня изоформ сывороточных цит b558  и цит b558 МКС и МКП. Механизмы снижения уровня цит b558 МКС и МКП ex vivo, видимо, не отличаются от такового in vitro. Однако снижение уровня изоформ цит b558 и повышение уровня супрола сыворотки, возможно, обусловлено тем, что L-аргинин вызывает увеличение активности каталазы и отпадает необходимость формирования сывороточных цит b558, которые, по предварительным данным, обладают некоторой каталазомиметической активностью [2]. Стабилизация супрола L-аргинином считается важным фактором сохранения микровязкости крови и, в целом, обеспечения микроциркуляции крови. 

Направленность изменений НАДРН-зависимой супероксидпродуцирующей активности изоформ цит b558 ЭМ, МКС и МКП под влиянием L-аргинина сохраняется. Наблюдается снижение НАДРН-зависимой супероксидпродуцирующей активности изоформ цит b558 ЭМ, МКС и МКП как в гомогенной фазе (в растворе), так и  мембранах клеток (гетерогенная фаза) (таблица, в). Эта активность резко снижена у цит b558 MKC. Снижение этой активности может также считаться антиоксидантным эффектом L-аргинина. Однако изоформы цит b558 различного характера являются ключевыми компонентами для НАДРН оксидазы, локализованной в клетках иммунной системы, для продуцирования АФК, в первую очередь О₂^–  при фагоцитозе, для нейтрализации антигенов [13]. Cнижение уровня и О₂^{– _-}продуцирующей активности изоформ цит b558 L -аргинином может ослабить иммунную защиту организма.

Интересно и то обстоятельство, что в отличие от цит b558III ЭМ, цит b558 МКС и МКП продуцируют О2– без добавления НАДРNa2 более медленно, чем при добавлении последнего. Продуцирование О2– восстанавливает цит С (СОД подавляет это восстановление). Процесс такого восстановления цит С существенно подавлен под влиянием цит МКС и МКП (таблица, г). Эти данные свидетельствуют о том, что L-аргинин проникает не только через ЭМ [9], но и через МКС и МКП. Подавление супероксидпродуцирующей активности супрола (соответственно снижение скорости восстановления цит С супролом) также наблюдается под влиянием L-аргинина, что  является его антиоксидантным эффектом.

Направленность изменений метНb-восстанавливающей активности изоформ цит b558 ЭМ, МКС и МКП под влиянием L-аргинина in vitro и ex vivo одинаковая. L-аргинин вызывает повышение метНb-восстанавливающей активности изоформ цит b558, особенно у цит b558 МКС и МКП в гомогенной фазе. Это считается положительным фактором регулирования кислородного гомеостаза, так как только оксиНb (но не метНb) способен переносить молекулярный кислород к клеткам. При анемиях различного характера уровень метНb вместо 3% повышается до 20-25%.

Таблица

Относительное изменение (%) уровня и активности антиоксидантных и прооксидантных металлопротеинов тканей крыс после 48ч инкубирования металлопротеинов с 20мг/мл L-аргинином при 4oC и после пятидневного инкубирования гомогенатов тканей с L-аргинином в аналогичных условиях in vitro (полученные данные сравнены со 100% контрольными показателями, полученными в отсутствие L-аргинина), Р< 0,05, n = 6

а. Изменение уровня и активности антиоксидантных металлопротеинов

б. Изменение уровня прооксидантных металлопротеинов

в. Изменение НАДРН-зависимой О_2^–продуцирующей активности прооксидантных металлопротеинов (изоформы цит b558 и супрол)

г. Изменение цит С-восстанавливающей активности изоформ цит b558 и супрола

д. Изменение метНb-восстанавливающей активности изоформ цит b558

Таким образом, молекулярно-биохимические механизмы воздействия L-аргинина на уровень и активность ключевых МАА и новых типов МПА ассоциированы с характерным изменением уровня НАДРН-зависимой О_2¯–продуцирующей и метНb-восстанавливающей активности МПА. Механизмы антиоксидантного воздействия L-аргинина  in vitro и ex vivo обусловлены резким повышением каталазной активности, снижением НАДРН-зависимой  О_2¯– родуцирующей активности изоформ цит b558 МКС и МКП, а также  О_2¯– продуцирующей активности супрола. Эти изменения ассоциированы, возможно, с регулированием кислородного гомеостаза путем повышения метНb-восстанавливающей активности изоформ цит b558  под влиянием L-аргинина. 

Литература

1. Мжельская М.И. Биологическая функция церулоплазмина и его дефицит при мутации генов, регулирующих обмен меди и железа. Бюл. эксп. биол. мед., 2000, 130(8), с.124-132.
2. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Высокая резистентность сывороточных цитохромов b558I и b558II против перекиси водорода, по сравнению с другими гемопротеинами. В кн.: Актуальные вопросы военной медицины. ЕрГМУ им. М.Гераци, 1999, с.48-51.
3. Симонян М.А., Симонян Г.М. Способ получения металлопротеинов. Лицензия изобрет. N 341 Армпатента, Ереван, 1997.
4. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Способ получения цитохромов b из мембран эритроцитов. Лицензия изобрет.N908 Армпатента, Ереван, 2001.
5. Cristol J.P., Moggi M.F., Guerin M.C. et al. Nitric oxide and lipid peroxidation, C.R. Seances Soc.Biol.Fil., 1995, 189(5), p. 797-809.
6. Dhawan V., Handu S.S., Nain C.K., Ganguly N.K. Chronic L-arginine supplementation improves endothelial cell vasoactive functions in hepercholesterolemic and atherosclerotic monkeys, Mol.Cell Biochem., 2005, 269(1-2), p. 1-11.
7. Haklar G., Ulukaya D.C., Yuksel M. et al. Oxygen radicals and nitric oxide in rat mesenteric ischemia-reperfusion: modulation by L-arginine and NG-nitro-L-arginine methyl ester, Clin.Exp.Pharmacol., 1998, 25(11), p. 908-912.
8. Mesquita R., Picarra B., Saldanha C., Martines S.J. NO effects on human erythrocytes structural and functional properties: an in vitro study, Clin.Hemorheol.Microcirc., 2002, 27(2), p. 137-147.
9. Mogilintskaia L.V., Fan A. et al. Effects of arginine on properties of the erythrocyte membranes in hypoxia, Bull.Exp.Biol.Med., 1992, 113 (5), p.457-498.
10. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. The reduction of ferrihemoglobin by erythrocytes membranes cytochrome b558III at various pathological states in vitro, NAS RA Electr. J. Natural Sciences, 2006, 2(7), p. 3-6.
11. Skliarov O.Ja., Fedevych Iu.M., Melekh O.Ja., Stadnyk V .V.  Effect of L-arginine on antioxidant system and НАДPH2-dependent methemoglobinreductase activity in rats blood, Fiziol.Zh., 2006, 52(2), p. 74-79.
12. Suessenbacher A., Lass A., Mayer B., Brunner F. Antioxidative and myocardial protective effects of L-arginine on oxygen redical-induced injury of isolated perfused rat hearts, Naunyn Schmiedebergs, Arch. Pharmacol., 2002, 365(4), p. 269-267.
13. Vignais P.V. The superoxide-generating NADPH oxidase:  structural aspects and activation mechanism, Cell Mol.Life Sci., 2002, 59(9), p. 1428-1459.A

Вопросы, ответы, комментарии