Противоопухолевый и антистрессорный эффект супрола, введенного белым крысам при саркоме-45 (Экспериментальная и профилактическая медицина)

Ключевые слова: супрол, саркома-45, противоопухолевый, антистрессорный эффект, металлопротеины

Молекулярно-биохимические механизмы канцерогенеза в эксперименте (при саркоме-45, саркоме-37 и др.), связанные с характерными комплексными изменениями уровня и активности супероксид-продуцирующих и утилизирующих металлопротеинов под действием различных противоопухолевых агентов, пока еще определены недостаточно. При саркоме-45 (С-45) у крыс введенный циклофосфамид регулирует уровень катехоламина в органах иммунной системы (тимус, селезенка), проявляя антистрессорный эффект [16]. Опухолевые клетки оказывают низкую толерантность против гипертермии. При лимфосаркоме Плисса и С-45 электромагнитное облучение (частота 40 МГц), сочетанное с гипертермией (38-40^o), вызывает подавление роста опухолевых клеток у крыс [20]. В отдельности гипертермия` (42-43^o) также оказывает противоопухолевый эффект при С-45 [15]. Антиопухолевый эффект при С-45 оказывает и интерлейкин-2 при гипертермии (42,5^oв течение часа) [21]. При С-45 у крыс комбинированное применение циклофосфамида и инфракрасного лазерного облучения низкой энергией оказывает противоопухолевое действие, снижая побочные повреждающие эффекты циклофосфамида [23]. Препараты хлофиден и украин [13,22], а также комбинированное применение X-облучения и гипоксии [17] оказывают противоопухолевый эффект при С-45. 

Фактически антиопухолевые агенты в большинстве обладают антиоксидантным (утилизируют активные формы кислорода – АФК) или, наоборот, прооксидантным (продуцируют АФК) действием. АФК (О₂¯, H₂O₂, HO^• и др.) в физиологических количествах являются крайне важными компонентами жизненно необходимых промежуточных аэробных метаболических процессов, участвуют в процессах регуляции, развития и пролиферации, а также окислительно-восстановительного статуса клеток. Однако при повышенных концентрациях эти высокоактивные АФК вызывают оксидативное повреждение различных компонентов клеток [19]. Широкоизвестные противоопухолевые препараты (винбластин, неокарциностатин, цисплатин, митомицин С, доксорубицин, циклофосфамид, аностатин и многие другие) оказывают антираковый эффект за счет АФК-зависимой стимуляции гибели опухолевых клеток, что свидетельствует о потенциальном использовании АФК как антиопухолевого средства [14]. 

Ключевыми источниками образования АФК в нормальных и опухолевых клетках являются изоформы NADPH оксидазы (Nox), а активность продуцирования О₂¯ NADPH оксидазой в опухолевых клетках выше по сравнению с нормальными клетками и эти О₂¯ регулируют рост и транскрипцию генов и окислительно-восстановительного статуса опухолевых клеток [11,25]. При этом ингибитор Nox – дифениленйодиниум снижает рост и транскрипцию генов опухолевых клеток. NADPH оксидазы играют ключевую роль в регуляции генома, митохондриального дыхания, иммунной активности и кислородного гомеостаза [1,2,27]. 

Доказано, что мембранные субъединицы NADPH оксидазы локализованы на поверхностных участках мембран нормальных и опухолевых клеток и ответственны за продуцирование О₂¯, выходящих в экстрацеллюлярную среду. NADPH оксидаза локализована также на поверхности дыхательных нейроэпителиальных клеток и в мембранах плазменных элементов, полиморфонуклеарных лейкоцитов, фагоцитов [12,18, 28].

Водорастворимые Nox (изоформы цитохрома b₅₅₈) выделены и очищены из эритроцитарных мембран, мембран, митохондрий и ядер клеток органов иммунной системы (селезенка, костный мозг) и сыворотки крови (экстрацеллюлярная Nox – еNox) млекопитающих (человека, быка, крыс, мышей) [7-9]. Эти ферменты обладают как NADPH-зависимой О₂¯-продуцирующей, так и ферри-гемоглобин(ферри-Нb)-восстанавливающей активностью [3,24]. При этом содержание еNox существенно увеличивается у опухоленосителей (лимфобластическим и миелобластическим лейкозом у человека) [8] при хронической кадмиевой интоксикации крыс [10]. 

Из сыворотки крови млекопитающих (человек, бык, крыса, мышь) был выделен NADPH-содержащий О₂¯-продуцирующий липопротеин высокой плотности – супрол, который продуцирует О₂¯ после активации следами ионов переходных металлов (Fe⁺³, Cu⁺²) in vitro [4-6]. При этом введенный крысам супрол, выделенный из сыворотки плацентарной крови женщин и активированный следами ионов Fe⁺³ увеличивает количество лейкоцитов, подавляет рост опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса и саркомы М-1 в среднем на 52% и 31% соответственно. При этом под влиянием 15 мкг/мл супрола наблюдается повышение пролиферации куриных эмбриональных клеток. Однако, при концентрации 50 мкг/мл и выше, супрол, из-за повышенного продуцирования О₂¯, вызывает лизис этих клеток. В отличие от других О₂¯ -продуцирующих систем, супрол является естественным, энергичным, стабильным и беспрерывным продуцером О2¯ (сохраняет свою активность в течение 6-8 месяцев при замороженном состоянии) и не оказывает токсического эффекта [4]. 

Цель работы – определение возможной противоопухолевой активности супрола (как агента интенсивного продуцирования О2¯) в лечебном режиме с регулированием уровня и активности металлопротеинов прооксидантной (изоформы Nox) и антиоксидантной активности (COД1, СОД2, каталаза), эритроцитов, сыворотки и клеток селезенки при С-45 у крыс. 

Материал и методы

Противоопухолевое действие активного супрола было испытано в лечебном режиме при С-45 у крыс. Ткань С-45 (10 г) размельчали, не повреждая клетки, в 20 мл физиологического раствора и инокулировали 1 раз (по 0,5 мл) [4].

 Белые беспородные крысы-самцы массой 200-220г, были разделены на три группы (по 8 в каждой). Kрысам первой опытной группы (ОГ-1) подкожно вводили по 1 мл этой смеси опухолевых клеток. Животным ОГ-2 вводили клетки С-45 и через 72 ч им в том же объеме вводили активный супрол (120 мкг/мл) также подкожно, 4 раза через 2 суток. Крысы контрольной группы (КГ) вместо супрола получали по 1 мл физиологического раствора в аналогичных условиях.

Выделение фракции супрола из сыворотки крови крыс и его активирование in vitro

Фракции супрола из сыворотки крови животных выделяли по ранее описанной нами методике [3,6]. В частности, отдиализованную против воды сыворотку (по 40 мл) подвергали ионообменной хроматографии на ДЕ-52 целлюлозе, уравновешенной 0,005 М калий-фосфатным буфером (КФБ), рН 7,4. Неактивный супрол элюировали 0,02 М КФБ и пропускали через биогель Р-150, уравновешенный 0,01 М КФБ. Центральную слабоопалисцирующую фракцию супрола собирали, концентрировали и активировали (для автономного продуцирования О₂¯) присоединением ионов Fe⁺³ (5•10^-7 M). Следы неприсоединившихся к белку ионов железа удаляли пропусканием белка через колонку с ДЕ-52 целлюлозой. 

Супероксид-продуцирующую активность супрола определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом. Расчеты показывали, что 150 мкг/мл активный супрол продуцирует до 5•10^-6М О₂¯ в 1 мин при 25^o.

Выделение фракции изоформ NADPH оксидазы (Nox) из мембран и ядер клеток селезенки крыс 

После промывания селезенок (по 2 г) физиологическим раствором и взвешивания гомогенизацию проводили в 0,25 М сахарозы (1г ткани в 10 мл сахарозы) стеклянным гомогенизатором с тефлоновым пестиком в течение 1 мин при 4^оС. Ядра клеток селезенки (ЯКС) осаждали центрифугированием гомогената при 3000 об/мин в течение 10 мин. Митохондрий удаляли после центрифугирования надосадочного раствора при 12 000 об/мин, в течение 15 мин. Мембраны клеток селезенки (МКС) осаждали центрифугированием полученного надосадочного раствора при 6000 об/мин и рН 5,6 в течение 15 мин. Далее осадки ЯКС и МКС промывали водой (1:100 об/об) и повторно центрифугировали (10 000 об/мин, 10 мин). Очищенные от следов сахарозы и других сопутствующих водорастворимых солей ЯКС и МКС смешивали с водой (1:5 об/об) и повторно гомогенизировали в аналогичном режиме. После солюбилизации фракции изоформы Nox из очищенных ЯКС и МКС, удаления нерастворимых осадков центрифугированием и диализа надосадочных растворов против воды, фракции изоформ Nox из ЯКС и МКС подвергали ионообменной хроматографии на колонках с целлюлозой КМ-52 (для удаления следов гемоглобина или других сопутствующих белков основного характера). Не задерживающиеся на колонке с КМ-52 белковые фракции далее подвергали ионообменной хроматографии отдельно на колонке с целлюлозой ДЕ-52 (уравновешенной 0,004 М КФБ). После промывания колонки сначала водой, а затем  0,01 М КФБ, pH 7,4 изоформы Nox кислой природы из ЯКС или МКС элюировали 0,2 М КФБ [9]. 

Выделение фракции экстрацеллюлярной Nox из сыворотки крови животных

Фракция еNox из сыворотки крови крыс была получена методом ионообменной хроматографии на колонках с сефадексом ДЕАЕ А-50 и целлюлозой ДЕ-52 [8]. Следы эритроцитов и плазменных клеток из сыворотки крови (по 3 мл) были удалены путем их центрифугирования при 14 000 об/мин, 15 мин. Супернатант (бледно-розового цвета) инкубировали в аэробных условиях в течение 4 суток при 4^o. Далее после центрифугирования в приведенных условиях и разбавления водой, фракцию еNox выделяли ионообменной хроматографией надосадочного раствора на колонке с сефадексом ДЕАЕ А-50 с элюированием 0,04 М КФБ. После разбавления этого элюата водой (10 раз) и ионообменного хроматографирования на колонке с целлюлозой ДЕ-52, фракцию еNox элюировали 0,04 М КФБ.

Выделение фракции изоформы Nox из эритроцитарных мембран (ЭМ) крыс

Фракцию Nox из ЭМ выделяли после солюбилизации ее из ЭМ (из 1,5 мл эритроцитов), диализа против воды, центрифугирования и ионообменной хроматографии супернатанта на колонке с целлюлозой KM-52 и DE-52, из последней колонки фракцию Nox элюировали 0,2 М КФБ [7].

Уровень Nox определяли путем измерения плотности оптического поглощения раствора Nox при 530 нм (β-полоса поглощения). Удельное содержание Nox из МКС, ЯКС, ЭМ и еNox определяли из расчета на 1 мл раствора Nоx, полученного из 1 г селезенки, 1 мл сыворотки и 1 мл эритроцитов. 

Выделение фракции СОД1 и каталазы из цитозоля эритроцитов крыс

Суммарную фракцию СОД1 (Cu,Zn-СОД) и каталазы из цитозоля эритроцитов выделяли после центрифугирования гемолизата эритроцитов при рН 5,6, диализа против воды, центрифугирования и ионообменного хроматографирования супернатанта на колонке с целлюлозой ДЕ-52, из которой суммарную фракцию СОД1 и каталазы элюировали 0,04 М КФБ [5]. 

Выделение суммарной фракции СОД1, СОД2 и каталазы из цитозоля клеток селезенки животных

Суммарную фракцию СОД1 и СОД2 (Mn-СОД) и каталазы из цитозоля селезенки выделяли после диализа последней против воды, центрифугирования и ионообменного хроматографирования супернатанта на целлюлозе ДЕ-52 и элюацией этой фракции 0,1 М КФБ [5]. 

Определение NАDРН-зависимой О₂¯-продуцирующей активности изоформ Nox

NАDРН-зависимую О₂¯-продуцирующую активность изоформ Nox определяли НТС методом, путем вычисления процента образующегося формазана при 560 нм в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу NАDРН- зависимой О_2¯ продуцирующей активности Nox принимали количество белка (плотность оптического поглощения β-полосы при 530 нм), которое стимулирует образование формазана на 50%. Удельная NADPH-зависимая О₂¯-продуцирующая активность Nox была определена в расчете на 1 мл эритроцитов, 1 мл сыворотки, 1 г селезенки [25]. 

Определение ферриHb-восстанавливающей активности изоформ Nox 

ФерриНb-восстанавливающую активность изоформ Nox определяли, используя свежеполученный ферриНb из цитоплазмы эритроцитов крыс и мышей с величиной плотности оптического поглощения (α-полоса поглощения) при А₅₆₅=0,8 оптических единиц. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра к 3 мл раствора ферриНb добавляли 0,2 мл Nox с А₅₃₀ = 0,3. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16 ч при 30^o. Далее, после повторного перемешивания реакционной смеси, определяли кинетику восстановления ферриHb до ферроHb, путем измерения снижения плотности α-полосы поглощения ферриHb при 565 нм (это прямо пропорционально количеству образующегося ферроHb при А₅₅₅). За единицу ферриНb-восстанавливающей активности NADPH оксидазы принимали количество белка, вызывающего снижение плотности максимального оптического поглощения α-полосы ферриHb величиной до 0,05 оптической единицы в течение часа при 20^oС. Удельная ферриНb-восстанавливающая активность изоформ NADPH оксидаз была определена в расчете на 1 мл эритроцитов, 1 мл сы-воротки и 1 г селезенки [24].

Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре “Specord UV/VIS” (Германия), с длиной оптического пути 1 см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности «p».

В процедуре получения белков использовали центрифуги К-70 и К-24 (“Veb MLW Zentrifugenbaum Engelsdorf”), Германия.

Результаты и обсуждение

Механизмы противоопухолевого действия супрола

Активированный супрол из сыворотки крови крыс (150 мкг/мл) продуцирует до 3•10^-6 М/мин О₂¯ при 25^o. Активный супрол является уникальным метаболитом продуцирования О₂¯, этот процесс беспрерывный и идет как в гомогенной фазе (в растворе), так и в гетерогенной фазе (когда происходит самоагрегация супрола, что наблюдается при его длительном хранении). При хранении (при 1-2^o в течение месяца) потеря активности супрола составляет всего 10-12%. Супрол является энергичным, естественным источником О₂¯ и приемлемым для различных биосистем NADPH- содержащим липопротеином высокой плотности и не оказывает нежелательных побочных эффектов (аллергия, токсикоз и пирогенность после вве-дения крысам даже в повышенных дозах). С другой стороны, под влиянием введенного супрола наблюдается приближение к норме числа лейкоцитов в периферической крови при лимфосаркоме Плисса, стимулирующее этим иммунную систему [4]. При этом при повышенных концентрациях, за счет продуцируемых О₂¯, супрол вызывает лизис опухолевых клеток. Действуя этими механизмами, супрол оказывает противоопухолевый эффект при С-45. Под влиянием внутрибрюшинно введенного супрола в приведенном лечебном режиме в течение 25 дней наблюдается снижение массы и числа (до 3-3,3 разa) подкожных очагов С-45 (табл.1).

Таблица 1

Масса oпухоли и число очагов С-45 в ОГ-1 и ОГ-2 (p‹0,05,n=6) 

Комплексообразование гемоглобина с Nox на поверхности мембран эритроцитов в ОГ-1

После промывания ЭМ практически не теряют свой красноватый оттенок в ОГ-1, в отличие от ЭМ КГ и ОГ-2 (в последних случаях ЭМ нормально промываются 0,04 М КФБ, приобретая бледно-розовый цвет). Действительно, после солюбилизации из ЭМ ОГ-1 оптический спектр поглощения Nox имеет смешанную форму спектрoв гемоглобина и Nox. Удаление примеси гемоглобина (Hb) достигалось при пропускании суммарной фракции комплекса Hb с Nox (цитохрома b558) через КМ-52, что приводило к возвращению спектра Nox в нативную форму. Интересен тот факт, что под влиянием супрола образование этого нестабильного комплекса предотвращается (в ОГ-2). Возможно, это связано с повышением стабильности ЭМ и подавлением липидной пероксидации, которая усиливается при злокачественных новообразованиях. Такое комплексообразование (его количественная характеристика) является новым и чувствительным маркером наличия злокачественного новообразования (лимфобластический и миелобластический лейкоз [8], саркома-37 [2], лимфосаркома [26], хроническая кадмиевая интоксикация [10] и т.д). 

Увеличение уровня и активности Nox в ОГ-1 по сравнению

 с ОГ-2 и КГ

При С-45 наблюдается существенное повышение уровня и небольшое увеличение NADPH-зависимой О₂¯-продуцирующей активности Nox из сыворотки крови (экстрацеллюлярная NADPH оксидаза или eNox), а также из ЭМ, МКС и ЯКС по сравнению с аналогичными показателями в ОГ-2 и КГ (табл.2,3). Механизм такого воздействия супрола скорее всего связан с эффектом продуцируемых супролом супероксидов на мембраны опухолевых клеток, со стимулированием липидной пероксидации ненасыщенных жирных кислот этих мембран, с изменением окислительно-восстановительного статуса этих клеток, вызывая их лизис.

Taблица 2

Уровень (плотность оптического поглощения при 530 нм) Nox в КГ, ОГ-1 и ОГ-2 (p‹0,03,n=6)

Taблица 3

NADPH-зависимая О₂¯ - продуцирующая активность изоформ Nox в КГ, ОГ-1 и ОГ-2 (p‹0,01,n=6)

Введенный интактным животным активный супрол приводит к незначительному увеличению числа лейкоцитов в периферической крови (11-14%), в то же время после введении активного супрола животным, носителям С-45 (ОГ-2), наблюдается повышение уровня лейкоцитов почти до уровня здоровых животных (уровень лейкоцитов больных животных повышается на 38-42 %). По-видимому, при подавлении роста опухолей немаловажную роль играет стимуляция лейкопоэза, приводящая к повышению сопротивляемости организма. 

Снижение ферриHb-восстанавливающей активности изоформ Nox в ОГ-1 и увеличение этой активности в ОГ-2

У крыс, носителей С-45, ферриHb-восстанавливающая активность изоформ Nox из ЭМ, МКС, ЯКС и сыворотки заметно снижается в ОГ-1 (табл.4), что свидетельствует о существенном нарушении кислородного гомеостаза при С-45. Возможно, что это ассоциировано с повышенным употреблением молекулярного кислорода в процессе продуцирования О₂¯ вышеуказанными Nox. Под влиянием введенного активного супрола наблюдается приближение ферриHb-восстанавливающeй активности изоформ Nox из ЭМ, МКС, ЯКС и сыворотки к норме (ОГ-2, табл. 4). Однако полученные данные не выявляют механизм эффекта регулирования кислородного гомеостаза супролом в ОГ-2. 

Таблица 4

ФерриHb-восстанавливающая активность изоформ Nox в КГ, ОГ-1 и ОГ-2 (p‹0,01,n=6)

Увеличение активности антиоксидантных фермeнтов в цитозоле селезенки и эритроцитов в ОГ-1 и их приближение к норме в ОГ-2 под влиянием супрола

При С-45 адаптационные механизмы крови вырабатывают соот-ветственное повышение активности СОД и, особенно, каталазы в приведенных биосистемах (ОГ-1), против повышенного уровня О₂¯ и перекиси водорода, которая является продуктом ферментативного дисмутирования О2¯. Введенный супрол несколько снижает эту активность, приближая ее к норме при СОД, оставляя еще выше нормы активность каталазы (табл.5).

 Taблица 5

Активность СОД и каталазы в КГ, ОГ-1 и ОГ-2 (р‹0,05, n=6)

Состояние супрола в ОГ-1 и ОГ-2 

При чрезмерном воздействии продуцируемых супролом О₂¯, последние могут инициировать липидную пероксидацию фосфолипидных остатков самого супрола (они ответственны за растворимость этого липопротеина), вызывать его самоагрегацию и снижение уровня выделенного супрола (ОГ-1). Однако и в этом состоянии потери О₂¯ -продуцирующей активности супрола не происходит, более того, наблюдается некоторое увеличение этой активности в ОГ-1. В ОГ-2 экзогенно введенный супрол, полученный из сыворотки крови крыс, вероятно, компенсирует потерю уровня эндогенного супрола, тем самым вызывая приближение его к норме (табл. 6). 

Taблица 6

Уровень и О₂¯-продуцирующая активность супрола в КГ, ОГ-1 и ОГ-2

 (р‹0,02, n=6)

Супероксиды губительно действуют на опухолевые клетки, в которых заметно понижен уровень антирадикальных защитных систем. Их действие на нормальные клетки менее ощутимо, так как в них имеется достаточное количество антиоксидантных защитных систем. Можно предположить, что и увеличение (в нашем случае с введением активного супрола), и уменьшение (подачей антиоксидантов) уровня, необходимого для обеспечения жизнедеятельности клеток (опухолевых или нормальных), в равной мере приводят к их гибели, особенно в тех случаях, когда величина амплитуды этих изменений велика. 

Мы использовали активный супрол, полученный из сыворотки крови здоровых крыс. Однако использование активированного супрола из сыворотки крови крысы, носителя С-45, в постоперационном периоде было бы более приемлемым, так как исключает перенос инфекции из других организмов, а также других нежелательных явлений (антигенность, аллергия и др.). С другой стороны, использование супрола, носителя опухоли, в постоперационном периоде увеличивает шансы его применения в клинической практике, как эффективное, естественное и энергичное противоопухолевое средство. 

Можно заключить, что механизмы противоопухолевого эффекта активированного супрола ассоциированы с беспрерывным продуциро-ванием достаточного количества О₂¯, увеличением числа лейкоцитов, регулированием уровня антиоксидантных и прооксидантных металлопротеинов – регуляторов метаболизма активных форм кислорода, а также иммунной системы (для которой изоформы Nox являются ключевыми ферментами продуцирования О₂¯ для нейтрализации антигенов). Активный супрол фактически увеличивает и стабильность эритроцитов, одновременно регулируя кислородный гомеостаз. 

Полученные результаты дают научное обоснование для предклинического испытания и применения супрола, полученного из сыворотки крови человека-опухоленосителя в постоперационном периоде для нейтрализации метастаз. 

Литература

1. Алексанян М.К. Оптические спектральные характеристики и активности фракции цитохрома b558 из клеток ткани аденокарциномы тонкой кишки человека. Вопросы теорет.клин.мед., 2010, т.13, 4, с. 68-70. 
2. Алексанян М.К., Галоян К.А., Симонян Г.М. и др. Повышение NADPH зависимой супероксид-продуцирующей и ферриHb-восстанавливающей активностей изоформы цитохрома b558 кислого характера из клеток опухолевой ткани саркомы-37 мышей под влиянием богатого пролином полипептида (БПП-1) in vitro. Вопросы теорет.клин.мед., 2010, т.13, 2, с. 54-57. 
3. Симонян М.А., Карапетян А.В., Бабаян М.А., Симонян Р.М. NADPH содержащая, супероксид-продуцирующая липопротеиновая фракция из сыворотки крови. Выделение, очистка, краткая характеристика и механизм действия. Биохимия, 1996, т.61, 5, с.932-938. 
4. Симонян М.А., Карапетян А.В., Галстян Д.А., Симонян Р.М., Симонян М.А. Суперок-сид-продуцирующий липопротеин как фактор подавления роста опухолей, повышения числа лейкоцитов, ускорения деления клеток в культуре. Биохимия,1996, т.61, 9, с.1578-1583. 
5. Симонян М.А., Симонян Г.М. Способ получения металлопротеинов крови. Лицензия изобрет.Армпатента, 341, Ереван, 1997. 
6. Симонян Г.М., Бабаян М.А., Симонян Р.М., Симонян М.А. Активация супероксид-продуцирующего липопротеина ионами некоторых переходных металлов in vitro и in vivo. Биол.ж.Армении, 1999, т.1, 52, с. 18-21.
7. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Способ получения цитохрома b558 из эритроцитарных мембран. Лицензия изобрет. Армпатента, N 908. Ереван, 2001. 
8. Симонян Г.М. Цитохром b558 из венозной крови человека при лимфобластическом и миелобластическом лейкозах и изменение баланса между эндогенными уровнями металлопротеинов крови. Мед.наука Армении НАН РА, 2002, т. XLII, 2, с. 101-103. 
9. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Способ получения цитохрома b558 из клеточных компонентов.Лицензия изобретения Армпатентa, N 2233А, Ереван, 2008. 
10. Сираканян М.С., Аветисян А.А., Галоян А.А., Симонян М.А. Антистрессорный эффект пролином богатого полипептида и соединения ВАС-167 при хронической интоксикации крыс ионами кадмия. Мед.наука Армении НАН РА,  2006, т.XLVI, 4, с. 3-6.
11. Brar S.S., Kennedy T.P., Sturrock A.P. et al. An NAD(P)H oxidase regulates growth and transcription in melanoma cells. Am.J.Physiol.Cell Physiol., 2002, p. 1212.1224. 
12. Berridge M.V., Tan A.S. High-capacity redox control at the plasma membrane of mammalian cells: trans-membrane, cell surfice and serum NADPH-oxidases. Antiox.Redox Signal, 2000, 2(2):231-242. 
13. Deneka E.R. Morphometric and kinetic analysis of the growth of experimental sarcoma-45 in the presence of Ukrain. Drugs Exp.Clin.Res., 1998, v.24(5-6), p. 281-285.
14. Ilonen J.K., Räsänen J.V.,  Sihvo E.I., Knuuttila A. et al. Oxidativie stress in non-smаll lung cancer: role of NADPH oxidase and glutathione. Acta Oncol., 2009, v.48 (7), p.1054-1061. 
15. Ismail-Zade R.S. Whole body hyperthermia suplemented with urotropin in the treatment of malignant tumors. Exp.Oncol., 2005, v.27(1), p. 61-64.
16. Karelina I.V.  The impact of standard and autohemotherapy for catecholamine levels in the spleen and thymus of rats with sarcoma -45. Bull.Exp.Biol.Med., 2010, v.150(1),p. 68-70.
17. Likholat E.A., Reva A.D., Sokolov I.I., Chernaia V.I. The effect of X-ray radiation and hypoxia on the proteolytic activity of the normal rat spleen and during tumor growth. Radiobiologiia, 1991, v.31(1), p. 38-42.
18. Мzukami Y., Matsubara F., Matsukawa S. Cytochemical localization of peroxidase and hydrogen-peroxide-producing NADPH-oxidase in thyroid follicular cells of propyithiouracil-treated rats. Histochemistry, 1985, v.82(3), p. 263-268. 
19.  Oberley L.W. Mechanism of the tumor suppressive effect of MnSOD overexpression (Review). Biomed. Pharmacother., 2005, v.59, p.142-148.
20. Orel V.E., Dzatkovskaya N.N., Romanov A.V., Kozarenko T.M. The effect of electromagnetic field and local inductive hyperthermia on nonlynear dynamics of the growth of transplanted animal tumors. Exp.Oncol., 2007, v. 29(2), p. 156-158.
21. Potapnev M.P., Istomin Y.P., Ismail-Zade R.S., Zhavrid E.A. Enhancement of antitumor response to sarcoma-45 in the rats by combination of whole-body hyperthermia and interleukin-2. Exp.Oncol., 2004, v. 26(1), p. 67-70.
22. Sharykina N.I., Kudriavtseva I.G., Pavlovskaia G.P. Mechanism of action of a novel antitumor preparation of chlofiden. Effect of RNA synthesis. Ukr.Biokhim.Zh., 2003, v. 75(1), p. 90-97.
23. Sheiko E.A., Shikhliarova A.I., Kurkina T.A. Experimental use of low-energy infrared laser radiation to stimulate antitumor effect of cyclophosphamide. Vopr.Oncol., 2004, v. 50(5), p.576-579.
24. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. The reduction of ferrihemoglobin by erythrocytes membranes cytochrome b558III at various pathological states in vitro. Electronic J. of Natural Sci.NAS RA, 2006, v. 2(7), p.3-19. 
25. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A., Galoyan A.A. Stimulation of the NADPH depending superoxide-producing and methemoglobin-reducing activities of new isoforms of cytochromes b558 by PRP-1 and GxNH2. Neurochem.Res., 2008, v. 33, p. 1155-1156. 
26. Simonyan G.M., Galoyan K.G., Simonyan R.M., Simonyan M.A., Galoyan A.A. Proline rich polypeptide (PRP-1) increases the superoxide-producing and ferrihemoglobin-reducing activities of cytochrome b558 isoforms from human lymphosarcoma tissue cells. Neurochem.Res., 2011, v. 36(5), p. 739-745.
27. Vignais P.V. The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism. Cell. Mol. Life Sci., 2002, v. 59 (9), p.1428-1459. 
28. Younagson C., Nurse C., Yeger H., Curnutte J.T., Vollimer C., Wong V., Cutz E. Immuno-cytochemical localization on O₂^– -sensing protein (NADPH oxidase) in chemoreceptor cells. Microsc.Res.Tech., 1997, v. 37(1), p. 101-106. 

Вопросы, ответы, комментарии