Изменение проинфламаторными цитокинами оптических спектральных свойств супероксид-продуцирующеи и ферригемоглобин-восстанавливающей активностей изоформ ылбрн оксидазы крыс IN VITRO

Проинфламаторные цитокины (ФНО-альфа, Ил-4 и ИФ-альфа) оказывают характерное изменение метаболизма активных форм кислорода (АФК) в различных клеточных образованиях млекопитающих. При инфекции и воспалении различного характера стимуляторами нейтрофилов повышают в них активность КАБРИ оксидазы, а проинфламаторные цитокины (GM-CSF, ФНО-альфа, Ил-8) модулируют активность этого фермента [18]. ФНО-альфа повышает активность NADPH оксидазы (Nох) в ПМН лейкоцитах и является потенциальным активатором Кох-1 в эпителиальных клетках кишок крыс, человека и мы-шей, а также микрососудов мозга свиней [1-4]. Механизмы повышения активности Кох цитокином ФНО-альфа в большинстве связаны с фосфорилированием Nох (р47 рhох) [3,5]. Проинфламаторные цитокины ФНО-альфа и ИФ-гамма кооперативно включены в процесс микроглиальной активации и повышают экспрессию ферментов i нитрит оксид синтазы (iHОС), gp 91 рЬох и циклооксигеназы, вызывая восспалительные процессы, апоптоз и гибель мотонейронов [6]. ИЛ-10 существенно подавляет ИФ-гамма- и ФНО-альфа- зависимого продуцирования супероксидов (О₂^-), путем снижения экспрессии Nох-1 в клетках кишечной ткани крыс [7]. ФНО-альфа и ИФ- гамма индуцируют дифференциацию клеток колонии HL-60, повышая экспрессию и активность Nох [8]. В результате воздействия ФНО-альфа с клетками культуры коронарной артерии человека, на фоне повышения экспрессии Nох-4А, р22,47 и 67рhох, наблюдается усиленное продуцирование О₂^- и H₂O₂ (как продукта ферментативного дисмутирования О₂^-) [9]. ФНО-альфа является важным цитокином для клеток иммунной системы и при воспалении индуцирует многие клеточные ответы, включая апоптоз и некроз клеток, стимулирует процесс генерации О2- фагоцитирующими клетками сосудов, путем активации Nох-2 gр 91) и Nох-1 [10]. Другой проинфламатор- ный цитокин ИФ-альфа (ИФ-альфа 2Ь) индуцирует продуцирование фактора бета-1 трансформирующих гепатоцитов и их секрецию активными формами кислорода, генерированными КАБРИ оксидазой. Фактор бета-1 изменяет и антиоксидантную защиту клеток и индуцирует их програмную гибель. С другой стороны, КАБРИ оксидаза активируется ИФ- альфа 2b-ом через р38 митогенактивирующей протеин киназой [11]. ИФ-альфа 2b является ключевым компонентом секреции TGF-бета-1, стимулируемая активными формами кислорода, продуцируемыми мембрано-связанным КАБРИ оксидазным комплексом, при терапии гепатокарциномы. При этом АФК играют ключевую роль в ИФ-альфа 2b индуцированном апоптозе опухолевых клеток печени крыс [12]. Макрофаги и нейтрофилы оказывает неспецифическую бактериоцидную активность, благодаря продуцированию О₂^- NADPH оксидазой. Однако, избыточное продуцирование О₂^- вызывает оксидативное по-вреждение клеточных компонентов тканей. ИЛ-4, как цитокин Т-лимфоцитов, играет важную роль в процессе образования антител и подавляет О2- продуцирование макрофагами, путем снижения уровня тРНК, кодирующей gp91 рЬох. ИЛ-4 подавляет воспаление, вызванное макрофагами, включающими посттранскрипционное регулирование КАБРИ оксидазы (gp91 рhох) и транскрипционное регулирова-ние экспрессии инфламаторного цитокина [13]. ИЛ-4 регулирует образование mРНК и экспрессию протеина-1 в эндотелиальных клетках аорты мышей, путем продуцирования АФК, а фармакологические ингибиторы NADPH оксидазы существенно подавляют эти процессы [14]. При этом ИЛ-4 подавляет проду-цирование О₂^- макрофагами свиней, механизмом подавления экспрессии mРНК gp91 рhох с регулированием активности gp91 и р22 рhох [15]. Кох локализованы на поверхности клеток и продуцируют О₂^-, которые рилизируются в экстрацеллюлярную среду и могут действовать как антимикробиальные агенты. При этом иммунные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-13, ИФ- гамма) индуцируют продуцирование О₂^- [16]. ИЛ-4 играет важную роль в IgЕ синтезе в бета клетках и в ТЬ2 дифференциации в Т-клетках. ИЛ-4 регулирует биологическую активность этих клеток путем соединения к рецептору ИЛ-4 (ИЛ-4R) на поверхности клеток мишеней. ИЛ-4Я состоит из ИЛ-4R-альфа или ИЛ-2R гамма или Ил-13R -альфа цепей. В иммунных клетках КАБРИ оксидаза (р47 рhох) связывается с этими цепьями [17]. При дифференциации моноцитов в макрофаги под воздействием ИЛ-4 или GM-CSF подавляется активность р47 и р65 рhох [19]. Приведенные данные касаются взаимодействию указанных цитокинов (ФНО-альфа, ИЛ-4, ИЛ-альфа) с Nох на клеточном уровне. Однако, особенности непосредственного воздействия этих цитокинов на оптико-спектральные характеристики, КАБРИ зависимую О₂^--продуцирующую и ферригемоглобин (ферриHb)-восстанавливающую активности элек трофоретически гомогенных изоформ NADPH оксидазы (изоформы цитохрома b₅₅₈) из эритроцитарных мембран, мембран клеток селезенки и костного мозга крыс in vitro еще не определены. Определение этих показателей являлось целью работы.

Материал и методы

Выделение и очистка изоформ NADPH оксидазы (цитохрома b₅₅₈) кислой природы из мембран кле-ток селезенки крыс

NADPH оксидазу (или цит b₅₅₈ кислой природы) из водной смесей мембран клеток селезенки (МКС), выделяли и очищали лицензированным способом, без использования детергента для солюбилизации этих гемопротеинов (использовали 30г ткани селезенки). После промывания селезенок физраствором и взвешивания, их гомогенизировали в 0,25М сахарозы (1г ткани в 10мл сахарозы) стеклянным гомо-генизатором с тефлоновым пестиком в течение 1мин при 4^оС. Мембраны клеток осаждали дифференциальным центрифугированием. Осадок мембран промывали водой (1:50 об/об) и повторно центрифугировали (10000об/мин, 10мин). Очищенные от следов сахарозы и других сопутствующих водорастворимых солей МКС смешивали с водой (1:5об/об) и окончательно гомогенизировали в аналогичном режиме. После солюбилизации фракции изоформы NADPH оксидазы из очищенных МКС, удаления нерастворимых осадков центрифугированием и после диализа надосадочного раствора против воды, фракцию изоформ цит b₅₅₈ из МКС подвергали ионобменной хроматографии на колонке с целлюлозой КМ-52 (для удаления следов гемоглобина или других сопутствующих белков основного характера). Не задерживающиеся на колонке с КМ-52 белковые фракции далее подвергали ионобменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЕ-52. После промывания этой колонки сначала водой, а затем - 0,01М калий фосфатным буфером рН 7,4 (КФБ), изоформу цит b₅₅₈ кислой природы из колонки ДЕ-52 элюировали 0,2М КФБ. После гель-фильтрации этой NADPH оксидазы МКС на колонке с сефадексом G100, центральные фракции очищались до электрофоретически гомогенного состояния [20].

Выделение и очистка изоформы NADPH оксидазы кислой природы из мембран клеток костного мозга (МККМ) крыс

Процедура получения электрофоретически гомогенной NADPH оксидазы кислой природы, из МККМ (последние выделяли из клеток ткани 4г костного мозга) проводилось аналогичным способом, используемого при получении этого фермрнта из МКС [20].

Выделение и очистка изоформы NADPH оксидазы кислой природы из эритроцитарных мембран (ЭМ)

Фракцию NADPH оксидазы выделяли лицензированным способом [21], путем их солюбилизации из ЭМ (последние выделяли из 20мл эритроцитов крови крыс), диализа против воды, центрифугирования и ионобменной хроматографии супернатан та на колонке с целлюлозой КМ-52 и DЕ-52 и гельфильтрации на колонке с сефадексом 0100 получали электрофоретически гомогенный препарат КАБРИ оксидазы кислой природы.

Выделение и очистка изоформы NADPH оксидазы из сыворотки крови (экстрацеллюлярный цит b₅₅₈)

После инкубирования очищенной от следов эритроцитов и плазменных клеток сыворотки в течение 4 суток при 4^о ее подвергали диализу против воды. После центрифугирования диализата (6000об/ мин, 10мин) и удаления из нее липопротеина высокой плотности - супрола повторным центрифугированием, фракцию экстрацеллюлярного цит  b₅₅₈ выделяли ионобменной хроматографией надосадочного раствора на сефадексе ДЕАЕ А-50 и элюированием 0,04М КФБ. После разбавления элюата водой (40 раз) и ионобменного хроматографирования на колонке с целлюлозой ДЕ-52, фракцию экстрацеллюлярного цит b₅₅₈  элюировали 0,04М КФБ. Путем гельфильтрации фракции цит b₅₅₈  на колонке с сефедексом 0100, центральная фракция имела электрофоретически гомогенное состояние [22]. Уровень цит b₅₅₈  определяли путем измерения характерной для цит b₅₅₈  оптической плотности при λ=А₅₃₀ (бета полоса поглощения). Удельное содержание цит b₅₅₈  (при λ=А₅₃₀) из ядер, митохондрий и МК селезенки, или из ЭМ или сыворотки крови определяли из расчета на 1мл раствора цит b₅₅₈  полученного из 1г селезенки,1мл сыворотки и 1 мл эритроцитов.

Определение ШАДРН зависимой О₂^- - продуцирующей активности изоформ ШАБРИ оксидаз (изоформ цит  b₅₅₈)

NADРН зависимую О₂^- - продуцирующую активность изоформ NADPH оксидазы (цит b₅₅₈ кислой природы) определяли нитротетразолиевым синим (НТС), путем вычисления процента образующегося формазана при 560нм в результате восстанав- ления НТС супероксидными радикалами. За единицу КАДРН зависимой О2 --продуцирующей активности цит Ь558 принимали количество белка (плотность оптического поглощения бета полосы цит Ь558 при 530 нм), которое стимулирует образование формазана на 50%. Удельная NADPH зависимая активность была определена в подсчете на 1мл эритроцитов, 1 мл сыворотки или 1г селезенки [23].

Определение ферриИb-восстанавливающей активности NADPH оксидазы (изоформ цит  b₅₅₈)

ФерриНb-восстанавливающую активность изоформы цит b₅₅₈ определяли используя свежеполученный ферриНb цитоплазмы эритроцитов крыс с величиной плотности оптического поглощения (альфа полоса поглощения) при А₅₆₅=0,8. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра, к 3мл раствора ферриНb добавляли 0,2мл цит  b₅₅₈ с λ при А₅₃₀ = 0,3. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16ч при 30^о. Далее, после повторного перемешивания реакционной смеси определяли кинетику восстановления ферриНЬ до ферроНЬ, путем измерения снижения плотности альфа полосы поглощения ферриНb  при 565нм (это снижение прямо пропорцио-нально образующемуся ферроНb при А₅₅₅). За единицу ферриНЬ-восстанавливающей активности цит b₅₅₈ принимали количество белка, вызывающего снижение плотности максимального оптического поглощения альфа-полосы ферриНb величиной до 0,05 оптической единицы в течение часа при 20о. Удельная ферриНb-восстанавливающая активность изоформы цит b₅₅₈ была определена в расчете на 1мл эритроцотов, 1мл сыворотки и 1г селезенки [24].

Условия инкубирования цитокинов (ФНО- альфа, ИЛ-4 и ИФ-альфа) с изоформами NADPH ок- сидазы in vitro

Электрофоретически гомогенные препараты изоформы NADPH оксидазы кислой природы, из МКС, МККМ, ЭМ, а также из сыворотки крови крыс (экстрацеллюлярная NADPH оксидаза) по 5мл, с А₅₃₀ = 0,25 инкубировали с приведенными цитоки- нами (по 0,1 мкг) в течение трех часов при 36^о (опытные пробы). Контрольные пробы NADPH оксидаз инкубировали в аналогичном режиме, в отсутствии цитокинов. Далее осуществляли непосредственное регистрирование оптических спектров поглощения, определения NADPH зависимой О₂^--продуцирующей и ферри НЬ-восстанавливающей активностей опытных и контрольных проб. Число проведенных опытов -6. Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре “Specord UV/VIS” (Германия), с длиной оптического пути 1см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия значимости р, при а=0.05.

Результаты и обсуждение

Использованные в работе количества цитокинов (ИФ-альфа, ФНО-альфа, Ил-4) для инкубирования с электрофоретически гомогенными изоформами NADPH оксидазы (цитохромы  b₅₅₈  из мембран клеток органов иммунной системы (МКС, МККМ), а также из ЭМ и сыворотки крови (экстрацеллюлярная NADPH оксидаза) in vitro ближе к количеству цитокинов, используемых в опытах in vivo [1-5]. Инкубирование в течение 3ч при 36о этих цитокинов с изоформами NADPH оксидазы приводит к неадекватному изменению NADPH зависимой O₂^-- продуцирующей и ферриНb-восстанавливающей активностей этих ферментов in vitro. В этих условиях ИФ-альфа вызывает значимое увеличение NADPH зависимой O₂^- -продуцирующей активности NADPH оксидазы из ЭМ и МККМ и подавления этой активности у NADPH оксидазы из МКС и сыворотки крови. ФНО-альфа и ИЛ-4 действуют одинаково, увеличивая эту активность у NADPH оксидазы из ЭМ, МКС, МККМ и практически не изменяет ее у экстрацеллюлярной NADPH оксидазы (табл.1). Эти данные, полученные в условиях in vitro, хорошо коррелируют с литературными данными, полученными in vivo [2,4,5,8,12,13,14,15]. С другой стороны, ИФ-альфа несколько подавляет ферриНЬ-восстанавливающую активность NADPH оксидазы из ЭМ, МКС и сыворотки и повышает ее у NADPH оксидазы из МККМ (табл.2). ФНО-альфа и ИЛ-4 существенно снижают ферриНb-восстанавливающую активность NADPH оксидазы из ЭМ, но повышают эту активность у NADPH оксидазы из МККМ, не изменяя ее у NADPH оксидазы из МКС и сыворотки. 

Таблица 1. NADPH зависимая О₂^- -продуцирующая активность изоформы NADPH оксидазы кислой природы из МКС, МККМ, ЭМ, а также из сыворотки крови крыс после 3 ч инкубирования при 36о этих ферментов с цитокинами (ИФ- альфа, ФХО-альфа, Ил-4) in vitro (p‹ 0,05, n=6)

Таблица 2. ФерриHb-восстанавливающая активность изоформ NADPH оксидаз кислой пророды из МКС, МККМ, ЭМ, а также из сыворотки крови крыс после 3 ч инкубирования при 36о этих ферментов с цитокинами (ИФ-альфа, ФХО- альфа, Ил-4) in vitro (р‹ 0,05, п=6)

Инкубирование этих цитокинов с приведенными изоформами NADPH оксидаз in vitro вызывает определенные изменения формы и интенсивности оптических спектров поглoщения этих NADPH оксидаз. Под влиянием ИФ-альфа в приведенных условиях наблюдается явление неполного восстановления Fe⁺³ гемовой группы КАБРИ оксидазы из МККМ, как это имеет место под влиянием восстановителя дитиони- та натрия (рис.1-а,б). ИФ-альфа своеобразно изменяет форму и интенсивность приведенных NADPHоксидаз (рис.2-а,б,в): из ЭМ (наблюдается повышение фона базовой линии спектра, как результат потери растворимости или повышения степени самоа- грегации этого фермента); из сыворотки крови (снижается поглощение Соре при 412нм с появлением слабого поглощения при 558нм, что может быть связано с явлением незначительного восстановления ионов железа в гемовой группе этого фермента); из МКС (снижается интенсивность характерного максимального оптического поглощения при 560 и 530нм). ФНО-альфа и ИЛ-4 действуют практически одинаково, вызывая потерю растворимости КАБРИ оксидазы из ЭМ, МКС и МККМ, со стимулированием процесса различной степени самоагрегации этих NADPH оксидаз (рис.3-1,3) и неизменностью формы и интенсивности экстрацеллюлярной КАБРИ оксидазы (рис.3-4,5). ФНО-альфа и ИЛ-4 не влияют на КАБРИ зависимую О₂^--продуцирующую и ферриНb- восстанавливающую активности экстрацеллюлярной КАБРИ оксидазы, в отличие от ИФ-альфа.

Рис.1. Оптические спектры поглощения электрофоретически гомогенной NADPH оксидазы из мембран клеток костного мозга крыс: а - до (1) и после инкубирования (3 ч при 36^о) этой NADPH оксидазы с 0,1 мкг ИФ-альфа (2).,б - оптические спектры поглощения этой NADPH оксидазы до (1) и после ее восстановления дитионитом натрия (б).

Рис. 2. Оптические спектры поглощения электрофоретически гомогенных изоформ NADPH оксидазы:а - выделенной из ЭМ до (1) и после инкубирования с ИФ-альфа в приведенном режиме (2)., б - оптические спектры поглощения электрофоретически гомогенной NADPH оксидазы из сыворотки крови (экстрацеллюл. NADPH оксидаза) до (1) и после инкубирования с ИФ-альфа в приведенном режиме (2)., в - оптические спектры поглощения электрофоретически гомогенной NADPH оксидазы из МКС до (1) и после инкубирования с ИФ-альфа в приведенном режиме (2).

Рис. 3. Оптические спектры поглощения изоформ электрофоретически гомогенной NADPH оксидазы: из ЭМ или МКС или МККМ до инкубирования с ИЛ-4 или ФНО-альфа (по 0,1 мкг) до (1) и после их инкубирования в приведенном режиме в отдельности с ИЛ-4 (2) и с ФНО-альфа (3). Оптический спектр поглощения электрофоретически гомогенной NADPH оксидазы из сыворотки крови до (4) и после ее инкубирования с ИЛ-4 или с ФНО-альфа (5,6).

После инкубирования приведенных изоформ NADPH оксидазы с ИФ-альфа, ФНО-альфа и ИЛ-4,представленные оптические спектральные изменения носят необратимый характер. С целью уда-ления следов этих цитокинов был использован метод ионобменной хроматографии на колонках с цел-люлозой ДЕ-52. Было показано, что в подавляющем большинстве наблюдается 15-20% потеря количества приведенных NADPH оксидаз. На основании этого явления можно констатировать, что указанные цитокины имеют способность необратимого прилипания к молекулам NADPH оксидазы и эта связь не расщепляется ионобменной хроматографией на целлюлозе ДЕ-52 (видимо прилипающие цитокины не-сколько изменяют кислотно-основные характеристики этих NADPH оксидаз, изменяя условия абсорб-ции и десорбции NADPH на колонке с целлюлозой ДЕ-52). Аналогичное явление прилипания к молекуле NADPH оксидазы различной локализации имело место в случае цитокина из нейросекреторных гранул, его синтетического аналога - Галармина. Действуя этим механизмом Галармин в небольших количествах стимулирует NADPH зависимую и ферриНЬ- восстанавливающую активности NADPH оксидаз из нормальных и атипичных (опухолевых) клеток, а эти ферменты являются рецепторами для цитокинов (Га- лармина) [25]. Эти данные, полученные в условиях in vitro, хорошо коррелируют с литературными данными, полученными in vivo [2-8,12-19].

T.o., цитокины различного характера (ИФ- альфа, ФНО-альфа, ИЛ-4) действуя своеобразным путем необратимо прилипают к молекулам ключевых NADPH зависимых О2- -продуцирующих ферментов -NADPH оксидаз из мембран клеток органов иммунной системы (селезенка, костный мозг), а текже из эритроцитарных мембран и из сыворотки крови (экстрацеллюлярная NADPH оксидаза), вызывая адек-ватное увеличение или снижение NADPH зависимой

О2--продуцирующей и ферриНb-восстанавливающей активностей этих ферментов in vitro.

Список литературы

1. Mazor R., Itzhaki O., Sela S., Yagil Y, Cohen-Mazor M., Yagil C., Kristal B. Hypertension, 2010, 55(2): 353-562.
2. Kuwano Y., Tominaga K., Kawahara T., Sasaki H., et al. Free Radic.Biol.Med., 2008, 45(12): 1642-1652.
3. Li J.M., Fan L,M., Christie M.R., Shah A.M. Mol.Cell. Biol., 2005, 25(6): 2320-2330.
4. Basuroy S., Bhattachara S., Lefler C.W., Parfenova H. Am.J.Physiol.Cell Physiol., 2009, 296(3):C422-C432.
5. Dewas C., Dang P.M., Gougerot-Pocidalo M.A., El-Benna J. J. Immunol., 2003, 171(8):4392-4398.
6. Mir M., Asensio V.J., Tolosa L., Gou-Fabregas M., Soler R.M., Llado’J., Olmos G. Neuroscience, 2009, 162(4):959- 971.
7. Kamizato M., Nishida K., Masuda K., Takeo K., et al. J.Gastroenterol., 2009, 44(12):1172-1184.
8. Lopez J.A., Newburger P.E.,Condino-neto A. J.Interferon cytokine Res., 2003, 23(12):737-744.
9. Yoshida L.S., Tsunawaki S. Int.Immunopharmacol., 2008, 8(10):1377-1385.
10. Kim Y.S., Morgan M.J., Choksi S., Liu Z.G. Mol.Cell.,2007,26(5):675-687.
11. Guiroga A.D., de Lujan Alvarez M., Parody J.P., Ronco M.T., Carnovale C.E., Carrillo M.C. Growth Factors, 2009, 27(4): 214-227.
12. Guiroga A.D., Alvarez Mde L., Parody J.P. et al. Biochem. Pharmacol., 2007, 73(11):1776-1785.
13. Zhou Y., Lin G., Muthaugh M.P. Biochim.Biophys.Acta, 1995, 1265(1):40-48.
14. Lee Y.W., Lee W.H., Kim P.H. Inflamm.Res., 2010, 59(9):755-765.
15. Zhou Y., Murtaugh M.P. Gene, 1994, 148(2):363-367.
16. Leto T.L., Geiszt M. Signal, 2006,8(9-10): 1549-1561.
17. Izuhara K., Arinohu Y, Sumimoto H., Nunoi H. Et al. Mol. Immunol.,1999, 36(1):45-52.
18. Gougerot-Pocidalo M.A., ei Benna J., Etoim C., Chollet- Martin S., Deng M.C. J.Soc.Biol., 2002, 196(1): 37-46.
19. Yu D., Imajoh-Ohmi S., Akagawa K., Kanegasaki S. J.Biol.Chem., 1996, 119(1):23-28.
20. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М. А. Лицензия изобрет. А2233 Армпатента. Ереван, 2008.
21. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М. А. Лицензия изобрет. N908 Армпатента. Ереван, 2001.
22. Симонян М.А., Симонян Г.М. Лицензия изобрет. N 341 Армпатента. Ереван, 1997.
23. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Симонян М.А., Галоян А.А. Мед.наука Армении, 2003 XLIII(1):30-34.
24. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. Electronic J.of Natural Sci.NAS RA, 2006, 2(7): 3-6.
25. Simonyan G.M., Galoian K.A., Simonyan R.M., Simonyan M.A., Galoyan A.A. Neurochem.Res.(published online:07 January 2011). 

Вопросы, ответы, комментарии