Новые подходы аутотерапии рака в постоперационном периоде

Изменение антиоксидантного или прооксидантного статусов опухолевых клеток в равной степени вызывает их апоптоз. Так, в присутствии N-метил-N'-нитро-N-нитрозо гуанидина процесс образования опухолевых клеток, на фоне повышения липидной пероксидации, существенно стимулируется, тогда как ферменты антиоксидантной активности (СОД, каталаза, ГПО) и антиоксиданты неферментного характера (ГБИ, витамин С, витамин Е) подавляют рост опухолевых клеток у опытных крыс. При этом, введенный крысам нарингенин, при индуцированной карциноме желудка, приводит к нарушению окислительно-восстановительного статуса опухолевых клеток и подавлению процесса их пролиферации. Фактически, путем регулирования уровня антиоксидантной защитной системы нарингенин оказывает антиопухолевый эффект [1]. Другие препараты, сваерофонин и паннарин, имея СОД-миметическую активность, оказывают протек- тивный эффект на ДНК плазмиды. Эти препараты подавляют рост клеток меланомы, вызывая апоп- тоз с фрагментацией ДНК клеток, заметное повышение активности каспаз-3 и продуцирования активных форм кислорода (АФК) [2]. Антиоксиданты селен и пикоцианин являются потенциальными противоопухолевыми агентами с антипролифера- тивной активностью [3]. Рекомбинированный Мп- СОД отдельно или совместно с адриамицином (ингибитор КАБРИ оксидазы) оказывает антиопухолевый эффект при саркоме-100, стимулируя иммунную систему, повышая уровень лимфоцитов в опу-холевых клетках, вызывая их апоптоз. [4]. АФК (О₂^-, Н₂О₂, НО•) в физиологических количествах являются крайне важными компонентами жизненно необходимых метаболических процессов, участвуют в процессах регуляции развития и пролиферации, а также окислительно-восстановительного статуса клеток. Однако при повышенных концентрациях эти высокоактивные АФК вызывают оксидатив- ное повреждение различных компонентов клеток, подвергая их деградации. С этой точки зрения, многие противоопухолевые агенты (винбластин, нео- карциностатин, цисплатин, митомицин С, доксору- бицин, циклофосфамид, аностатин и многие другие) оказывают антираковый эффект за счет АФК- зависимой стимуляции гибели опухолевых клеток, что свидетельствует о потенциальном использовании АФК как антиопухолевых средств. Таким образом, в стратегии антираковой терапии используется термин «окислительная терапия» с применением цитотоксических средств, вызывая повышение уровня АФК в клетках опухолевой ткани и подавление активности антирадикальной защитной системы опухолевых клеток [5]. Аналогичным путем пролин оксидаза оказывает противоопухолевый эффект. Этот флавоэнзим локализован в митохондриях и катализирует деградацию пролина, конвертируя его в пролин-5-карбоксилат [6].

Существуют данные о том, что в соответствующих количествах АФК участвуют в процессе злокачественного новообразования. На этом фоне ионизирующая радиация различной природы, а также ксенобиотики (например, полициклические ароматические гидроуглеводы и форбол эстер) стимулируют образование АФК, которые, в свою очередь, стимулируют образование рака [7]. Однако, повышение продуцирования АФК непосредственно в раковых клетках путем снижения активности Мn-СОД или активности NADPH оксидазы вызывает апоптоз этих клеток и может быть рекомендовано как возможное терапевтическое средство при меланоме [8]. С другой стороны, опухолевые клетки, по сравнению с нормальными (не опухолевыми), более толерантны против оксидатив- ного стресса, однако, уровень защитной антиоксидантной системы в опухолевых клетках ниже (около 10 раз) и они очень чувствительны к нарушению окислительно-восстановительного статуса, вызванного влиянием экзогенных АФК. При этом препарат партенолид избирательно активирует NADPH оксидазу и вызывает оксидативный стресс с нарушением окислительно-восстановительного статуса в опухолевых клетках простаты путем повышения продуцирования АФК и снижения их антиоксид антной активности [9]. Показано, что андрогены индуцируют повышение уровня АФК в опухолевых клетках поджелудочной железы, также вызывая оксидативный стресс. При этом наблюдается повышение экспрессии субъединиц р22(рhох) и gp91(phox) NADPH оксидазы и продуцирование АФК субъединицами N0X2 и N0X4 в клетках поджелудочной железы, а кофеиновая и ферулиновая кислоты снижают выживаемость и индуцируют гибель апоптических клеток в дозозависимой манере [10,11]. Однако под влиянием различных ингибиторов NADPH оксидазы (дифенилен йодониум, апо- цинин, неоптерин) наблюдается подавление продуцирования АФК и гибель опухолевых клеток [12]. Доказано, что мембранные субъединицы NADPH оксидазы локализованы на поверхностных участках мембран клеток и ответственны за продуцирование О₂^- во многих клетках (например, в В-лимфоцитах и остеокластах) и выход супероксидов в экстрацел- люлярную среду.NADPH оксидаза локализована также на поверхности дыхательных нейроэпителиальных клеток и в мембранах плазменных элементов, полиморфонуклеарных лейкоцитов, фагоцитов [13-17].

Впервые водорастворимые NADPH оксидазы (изоформы цитохрома b₅₅₈) выделены и очищены из эритроцитарных мембран и сыворотки крови человека, быка, крыс, мышей. Эти ферменты обладают как NADPH-зависимой O₂^- -продуцирующей, так и ферри-гемоглобин(ферриНb)-восстанавливающей активностями [18,19]. Причем, под влиянием ионизирующей радиации эритроцитарных мембран и ци тохромов (цит) b558 in vitro наблюдается повышение их агрегации с понижением NADPH-зависимой O₂^- -продуцирующей и ферри-Нb-восстанавливающей активностей [20,21]. После аэробного инкубирования крови или сыворотки крови млекопитающих (человек, бык, крыса, мышь) наблюдается резкое повышение уровня сывороточной (экстрацеллюлярной) изоформы цитохрома b₅₅₈. При этом содержание экс- трацеллюлярного цитохрома b₅₅₈ (NADPH оксидазы) существенно увеличивается при лимфобластическом и миелобластическом лейкозах у человека [22]. После разработки одновременного получения металло- протеинов антиоксидантной активности (МАА): изоформы СОД, каталаза, церулоплазмин и трансфер- рин и металлопротеинов прооксидантной активности (МПА): изоформы цит b₅₅₈, цит b₅, цит С, супрол [23] было показано, что в крови носителей опухоли слизистой оболочки полости рта и при гиперплазии простаты у человека наблюдается существенное повышение уровня МПА [24]. С использованием этого комплексного метода из сыворотки крови быка была выделена NADPH содержащая O₂^--продуцирующая липопротеиновая фракция высокой плотности - супрола, которая продуцирует O₂^- (активируется in vitro) в присутствии следов ионов переходных металлов (Fe⁺³, Cu⁺²). Введенный крысам супрол, полученный и активированный из сыворотки плацентарной крови человека, увеличивает количество лейкоцитов, подавляет рост опухолевых клеток лимфосаркомы и саркомы М-1 в среднем на 52% и 31% соответственно. При этом под влиянием 15 мкг/мл супрола наблюдается повышение пролиферации куриных эмбриональных клеток. 0днако, при концентрации 50 мкг/ мл и выше, супрол, из-за повышенного продуцирования O₂^- вызывает лизис этих клеток [25]. При раке молочной железы у женщин наблюдается снижение стабильности эритроцитов, что выражается проникновением гемоглобина на поврежденные участки эритроцитарных мембран с образованием нестабильного комплекса с цит b₅₅₈. Наряду с этим, NADPH зависимая O₂^-- продуцирующая активность цит b₅₅₈ из мембран эритроцитов у этих больных существенно повышается на фоне увеличения дисбаланса между МАА и МПА [26]. Аналогичный эффект наблюдается и при саркоме-45 у крыс. При этом внутри- брюшинно введенный синтетический аналог богатого пролином полипептида из нейросекреторных гранул гипоталамуса - галармин оказывает антистрессорный и антиопухолевый эффект [27]. Показано, что галармин (1,5-7 мкг/мл) стимулирует NADPH зависимую O₂^-- продуцирующую и ферриНb -восстанавливающую активности цит b₅₅₈ из ЭМ in vitro. Однако, в повышенных концентрациях (выше 50 мкг) галармин, наоборот, подавляет O₂^--продуцирующую активность цит b₅₅₈ и супрола. Этим путем галармин играет определенную регулирующую роль в процессе стимулирования иммунной системы и кислородного гомеостаза [28].

После разработки комплексных методов одновременного получения МАА и МПА из мембран эритроцитов, мембран, ядер и митохондрий клеток (в первую очередь из клеток органов иммунной системы: костный мозг, селезенка) [29,30], были определены характерные изменения уровня и активности этих металлопротеинов в норме и при различных типах заболеваний, включая и злокачественные новообразования. Выявлены и побочные эффекты лекарственных средств, используемых в канцеротерапии (циклофосфамид-ЦФ, доксорубицин-ДР). Эти препараты вызывают заметное повышение NADPH зависимой супероксид-продуцирующей и ферриHb- восстанавливающей активностей изоформ цит b₅₅₈ из ЭМ и мембран клеток селезенки. После аэробного инкубирования гомогенатов тканей с ЦФ (мозг, селезенка, костный мозг, печень, почки) наблюдается неадекватное отклонение от нормы уровня и активности МАА и МПА с повышением прооксидантного статуса клеток этих тканей. После трехкратного внутри- брюшинного введения крысам доксорубицина (ДР) 3- мг/кг/крыс) уровень и активность NADPH зависимых супероксид-продуцирующих изоформ цит b₅₅₈ из ЭМ, сыворотки, из клеток селезенки и костного мозга заметно повысилась (в среднем на 33-173%). Одновременно происходило снижение ферриHb- восстанавливающей активности этих цит b₅₅₈. Галармин (25 мкг/кг), введенный за 30 мин после введения ДР, существенно приближает уровень и активность этих цит b₅₅₈ к норме. Это дает основание для совместного использования ДР и галармина при раковых заболеваниях [31-35].

Впервые изоформы NADPH оксидазы кислой природы выделяются и из клеток опухолевой ткани молочной железы, лимфосаркомы, раковых клеток желудка, кишечника человека, из клеток асцитной карциномы Эрлиха у мышей, из саркомы-45 и саркомы-37 у крыс. Фактически, NADPH оксидаза регулирует иммунную систему и  окислительновосстановительные процессы при экспресии гена, дыхательные процессы митохондрий, а также кислородный гомеостаз. По форме и характерным максимумам оптического поглощения цит b₅₅₈ из саркомы -37 у крыс практически не отличается от таковых у цит b₅₅₈ кислой природы из неопухолевых клеток (селезенка, печень и ЭМ). 0днако цит b₅₅₈ из этих опухолевых клеток обладают повышенной NАDРН зависимой O₂^-- продуцирующей и пониженной ферриHb-восстанавливающей активностями. Галармин стимулирует и эти активности in vitro [28]. Из клеток лим- фосаркомы человека выделены две изоформы цит b558 кислой природы с использованием ионообменной хроматографии на целлюлозах КМ-52, ДЕ-52 и гель-фильтрации на сефадексе G-100. Эти изоформы цит b558 (или NADPH оксидазы) также обладают NADPH зависимой 02--продуцирующей и ферриШ- восстанавливающей активностями. Галармин также стимулирует эти активности in vitro, более того, связывается с этими белками. Эта связь практически не расщепляется в результате их гель-фильтрации на сефадексе G-100. Путем стимулирования NAD PH зависимой супероксид-продуцирующей и ферриШ- восстанавливающей активностей этой NADPH ок- сидазы, галармин может изменить окислительновосстановительный статус опухолевых клеток и вызывать их гибель [36]. Это является возможным механизмом противоракового эффекта галармина. Регулирующий эффект галармина на уровень и активность МАА и МПА связывается с двумя факторами:1)галармин является скавенджером Н0. - радикалов, которые денатурируют как МАА, так и МПА и 2)приведенные NADPH оксидазы являются рецепторами галармина с проявлением иммунномодулирующего эффекта.Фактически, как NADPH оксидазы нормальных клеток, так и опухолевых клеток являются рецепторами галармина [36]. Фактически, O₂^-, продуцируемые NADPH оксидазами являются ключевыми антимутагенными агентами. Изменение (повышение) уровня супероксидов экзогенными проду- церами O₂^- может быть эффективным подходом канцеротерапии. Немаловажно и то обстоятельство, что изменение уровня локализованной на поверхностных участках мембран опухолевых клеток КАБРИ оксидазы также могут вызывать лизис опухолевых клеток (метастаз) [36].

Исходя из того, что практически из всех типов раковых клеток мы выделяем изоформы NADPH оксидазы, появляется возможность получения антител (гамма-глобулинов) против этих ферментов. Эти антитела, нейтрализуя КАБРИ оксидазы, локализованные на поверхности мембран опухолевых клеток (метастаз), могут вызывать гибель этих клеток. Разумеется, эти подходы противораковой терапии для нейтрализации метастаз будут эффективными только после удаления опухолевой ткани. Мы предлагаем использование супрола (как естественного, энергичного и бесперерывного продуцера супероксидов) и КАБРИ оксидазы из опухолевых клеток (для получения антител), полученного из данного опухоленоси- теля (для предотвращения различного характера побочных явлений), в постоперационном периоде при аутотерапии рака. Предлагаются два пути аутотерапии рака (нейтрализация раковых клеток) в постопе- рационном периоде. 1. После удаления опухолевой ткани вызывать образование антител у этого же больного против внутривенно введенной изоформы NADPH оксидазы (или цит b₅₅₈), полученной из клеток удаленной опухолевой ткани. При предклиниче- ском испытании в эксперименте определить эффективную концентрацию (титр антител) цит b₅₅₈. 2. После удаления опухолевой ткани, из крови (100-150 мл) этого же больного выделить и активировать супрол и вводить его внутривенно. При предклиниче- ском испытании определить эффективную дозу и периодичность введенного супрола.

Список литературы

1. Ekambaram G., Rajendran P., Magesh V., Sakthisekaran D. Naringenin reduces tumor size and weight lost in N- methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine gastric carcinogenesis in rats. Nutr.Res., 2008, 28(2): 106-112.
2. Russo A., Piovano M., Lombardo L., Garbarino J., Cardile V. Lichen metabolites prevent UV light and nitric oxide- mediated plasmid DNA damage and induce apoptosis in human melanoma cells. Life Sci., 2008, 83(13-14): 468474.
3. Chen T., Wong Y.S. In vitro antioxidant and antiproliferative activities of selenium-containing phycocyanin from selenium-containing Spirulia platensis. J.Agric.Food Chem., 2008, 56(12): 4352-4358.
4. Chen C.S., Zhao Q., Weng J., Rong J.J., Yuan G.S., GuO Q.L., Wu W.T. Enhanced anti-tumor effects activated in a murine tumor model using combination therapy of recombinant human manganese superoxide dismutase and adriamicin. Biochem.Biophys.Res.Commun., 2008, 370(4): 663-668.
5. Fang J., Nakamura H., Iter A.K. Tumor-targeted induction of oxystress for cancer therapy. J.Drug Target, 2007(7- 8):475-486.
6. Liu Y., Borchert G.L., Surazynski A., Phang J.M. Proline oxidase, a p53-induced gene, targets COX-2/pGE2 signaling to induce apoptosis and inhibit tumor grouth in colorectal cancers. Oncogenese., 2008, 27(53): 6729-6737.
7. Gius D., Spitz D.R. Redox signaling in cancer biology. Antioxid.Redox.Signal, 2006(7-8):1249-1252.
8. Afanas’ev I.B. Signaling by reactive oxygen and nitrogen species in skin diseases. Curr.Drug. Metab., 2010, 11(5):409-411.
9. Sun Y., St Clair D.K., Xu Y., Crooks P.A., St Clair W.H. A NADPH oxidase - dependent redox signaling pathway mediates the selective radiosensitization effect of parthenolide in prostate cancer cells. Cancer Res., 2010, 70(7):2880-2890.
10. Lu J.P., Monardo L., Bryskin I., Hou Z.F., Trachtenberg J., Wilson B.C., Pinthus J.H. Androgens induce oxidative stress and radiation resistance in prostate cancer cells through NADPH oxidase. Prostatic Cancer Prostatic Dis., 2010, 13(1): 39-46.
11. Juhasz A., Ge Y., Markel S., Chiu A., Matsumoto L.,van Balgooy J., Ray K., Doroshow J.H. Expression of NADPH oxidase homologues and accessory genes in human cancer cell lines, tumours and adjacent tissues. Free Radic.Res., 2009, 43(6): 523-532.
12. Lee Y.S. Role of NADPH oxidase-mediated generation of racctive oxygen species in the mechanism of apoptosis induced by phenolic acid in Hep G2 human cells. Arch. Pharm.Res., 2005, 28(10):1183-1189.
13. 13.Hijenski L.L., Clempus R.E., Quinn M.T., Lambeth J.D., Griendling K.K. Distinct subcellular localization of Nox1 and Nox4 in vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb Vasc.Biol., 2004, 24(4):677-683.
14. Yang S., Hardaway M., Sun G., Ries Y. Key L.L. Superoxide generation and tyrosine kinase. Biochem.Cell Biol., 2000, 78(1):11-17.
15. Younagson C., Nurse C., Yeger H., Curnutte J.T., Vollimer C., Wong V., Cutz E. Immunocytochemical localization on O₂^--sensing protein (NADPH oxidase) in chemoreceptor cells. Micresc.Res.Tech., 1997, 37(1): 101-106.
16. Мzukami Y., Matsubara F., Matsukawa S. Cytochemo cal localization of peroxidase and hydrogen-peroxide- producing NADPH-oxidase in thyroid follicular cells of propyithiouracil-treated rats. Histochemistry, 1985, 82(3): 263-268.
17. Briggs R.T., Drath D.B., Karnovski M.L., Karnovski M.J. Localization of NADH oxidase on the surfice of human polymorphonuclear leukocytes by a new cytochemocal method. J.Cell Biol., 1975, 67(3):566-586.
18. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. The reduction of ferrihemoglobin by erythrocytes membranes cytochrome b₅₅₈in at various pathological states in vitro. Electronic J. of Natural Sci.NAS RA, 2006, 2(7):3-19.
19. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A., Galoy- an A.A. Stimulation of the NADPH depending superoxide-producing and methemoglobin-reducing activities of new isoforms of cytochromes b₅₅₈ by PRP-1 and GxNH2. Neurochem.Res., 2008, 33: 1155-1156.
20. Симонян Р,М., Симонян Г.М., Бабаян М.А., Симо- нян М.А. Х-облучение эритроцитарного мембранного цитохрома b558 III in vitro вызывает повышение агрегации цитохрома b₅₅₈ III и снижение его суперокцид-продуцирующей и ферригеноглобин- восстанавливающей активностей. Мед.наука Армении, 2004, XLIV(1): 43-46.
21. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. 0бразование сывороточного цитохрома b558 после аэробного инкубирования крови in vitro. Мед.наука Армении,2005,XLV(2):26-29.
22. Симонян Г.М. Цитохром b558 из венозной крови человека при лимфобластическом и миелобластическом лейкозах и изменение баланса между эндогенными уровнями металлопротеинов крови. Мед.наука Армении,2002,XLII(2): 101-103.
23. Симонян М.А., Симонян Г.М. Способ получения ме-таллопротеинов крови. Лицензия изобретения Армпа- тента N 341. Ереван, 1997.
24. Зограбян Ю.Г., Бороян Р.Р., Симонян Г.М., Симонян М.А. Содержание эндогенных про- и антиоксидант- ных металлопротеинов крови при гиперплазии простата. Мед.наука Армении, 1999, XXXIX (4):125-128.
25. Симонян М.А., Карапетян А.В., Галстян Д.А., Бабаян М.А., Симонян М.А. Супероксид-продуцирующий ли- попротеин как фактор подавления роста опухоли, повышения числа лейкоцитов и усиления пролиферации клеток в культуре. Биохимия, 1996, 61(9):1117-1120.
26. 26.Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Нерсесян А.К., Симонян М.А. Повышение кислотности эритроцитарного мембранного цитохрома b558, образование комплексного соединения с гемоглобином и изменение баланса между металлопротеинами антиоксидантного и прооксидантного действия в крови женщин при раке малочной железы. Мед. наука Армении, 2003, XLIII (2): 31-36.
27. Симонян Г.М., Нерсесян А.К., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Галоян А.А. Антиопухолевый и антистрессор- ный эффект гипоталамического богатого пролином пептида (PRP-1) при саркомы-45: возможные биохимические механизмы. Нейрохимия, 2005, 22(2): 125 130.
28. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Агамян Г.Р., Симонян М.А., Галоян А.А. Влияние богатого пролином полипептида на восстановленое метгемоглобина и продуцирование супероксидов металлопротеинами цитохромом b558 и супролом in vitro. Нейрохимия, 2007, 24(10):37-40.
29. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Способ получения цитохромов b558 из эритроцитарных мембран. Лицензия изобретения Армпатента N 908. Ереван, 2001.
30. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Способ получения цитохромов b558 из клеточных компонентов. Лицензия изобретения Армпатента N 2233. Ереван,2008.
31. Тадевосян Л.Г., Симонян Р.М., Симонян М.А., Геворкян Г.А. Влияние циклофосфамида на уровень и активность антиоксидантных и прооксигантных метал- лопротеинов ex vivo. Мед. наука Армении, 2009, XLIX (2):23-30.
32. Тадевосян Л.Г., Симонян Р.М., Симонян Г.М., Аракелян Л.Н., Айрапетян П.Л., Симонян М.А., Геворкян Г.А. Изменение толерантности анти- и прооксидант ных металлопротеинов крови крыс после аэробного инкубирования крови с циклофосфамидом. Мед. наука Армении, 2009, XLIX (3):57-65.
33. Тадевосян Л.Г., Аракелян Л.Н., Айрапетян Р.Л., Симонян М.А., Галоян А.А., Геворкян Г.А. Изменение уровня и активности анти- и прооксидантных металлопро- теинов тканей крыс под влиянием доксорубицина in vivo. Blood (Армения). 2010, 1(10):99-106.
34. Тадевосян Л.Г., Симонян Р.М., Симонян М.А., Геворкян Г.А. Влияние циклофосфсмида на уровень и активности металлопротеинов тканей ex vivo. Мед.наука Армении, 2009, XLIX (2):23-30.
35. Тадевосян Л.Г., Симонян М.А., Геворкян Г.А. Резкое повышение прооксидантного статуса тканей крыс при острой интоксикации циклофосфанидом. Мед.наука Армении, 2007, XLVII (4):34-38.
36. Simonyan G.M., Galoian K.A., Simonyan R.M., Si- monyan M.A., Galoyan A.A. Proline rich polypeptide (PRP-1) increases the superoxide - producing and ferrihe- moglobin raducing activities of cytochrome b558 isoforms from human lymphosarcoma tissue cells. Neurochem.Res. 2011,36(5):739-745.

Вопросы, ответы, комментарии