Морфо-гистохимическое изучение нейродегенеративных и регенеративных процессов в флексорном и экстензорном ответвлениях седалищного нерва после краша под воздействием гипотаёамического обогащенного пролином пептида-1 1 (РRР-1)

Введение

Продолжают оставаться недостаточно изученными механизмы развития нейроде- и регегенеративных процессов в очаге раздавливания периферического нерва (ПН), несмотря на интенсивные и всесторонние исследования в указанной области. Следует отметить особое внимание, уделяемое реакции глии [1].В ранних исследованиях выявлена даунрегуляция миелиновых генов, дедифференциация, проли-ферация в Шванновских клетках (ШК), создающие условия для прорастания регенерирующих волокон [2].Всвою очередь, в дистальной культе имеет место «апрегуляция» нейротрофинов, цитокинов, адгезия молекул нервной клетки и пр. [2]. В последние годы получены интересные данные. В ремиелинизации после нервного повреждения, важного и малоизученного аспекта нервной регенерации, установлена клю-чевая роль дизинтегрина и металлопротеаз. Помимо того, ремиелинизация показана в качестве модулятора сигнала от аксона, предшествующей дифференциации ШК и активирующего транскрипционный фактор миелинизации (Кгох-20) [3]. В иммуногистоло- гическом наблюдении пролиферации ШК после по-вреждения ПН у крыс, обнаружено, что ШК существенна для поддержки аксонной регенерации [9]. Обнаружен важный вклад внутриклеточных фосфо- липаз А(2) в различные аспекты Уоллеровской дегенерации и регенерации в ПН [4]. Установлено далее, что в случае краша ПН дигидропрогестерон уменьшает апрегуляцию плотности миелинизированных волокон, и взаимодействуя с прогестероном ослабляет боль и обеспечивает протекцию [5]. При локальном повреждении ПН поддерживается регенеративный спраут, несмотря на длительные альтерации в эпиневральной циркуляции, что свидетельствует о резистентности к эндоневральной ишемии [6]. Раз-умеется, улучшением техники изменения направления регенерирующих моторных аксонов, может быть обеспеченааккуратность регенерации [10]. При этом, существенные изменения в регенеративном спрауте может вызвать манипуляция микросредой нерва. Од-нако неизвестен механизм облегчения спраута, кото-рым, без очевидного изменения нервной архитектоники или кровообращения, обеспечивается регенера-ция в длинном поврежденном крашем нервном стволе, посредством генерации множества зрелых мие- линизированных аксонов [11]. К тому же, более дей-ственную регенерацию поперек длинных нервных повреждений инициирует интеграция биоинженерных лент Бюнгнера, основанная на микроструктурных полимерных филаментах в ПН [12]. В то же время, не уделено должного внимания флексорному нерву в условиях краша, как эволюционно более новой структуре, которая априори должна отставать в реге-нерации от экстензорного нерва, в силу своей большей приверженности супрасегментарному контролю и запаздывания в развитии регегенеративных процессов. В настоящей работе проведено сравнительное морфо-гистохимическое изучение динамики и степени развития нейроде- и регенеративных процессов флексорного (п. Gastrocnemius-G) и экстензорно- го (п. Регопеш соттиш8-Р) нервов нижней конечности после раздавливания или краша седалищного нерва (СН) без- и в условиях применения гипоталамиче- ского пролином обогащенного пептида (РИР-1). Ранее нами были опубликованы данные по использованию при краше СН паратиреоидного гормона [13].

Материал и методы

Эксперименты проводили на крысах-самцах Альбино (п=18; 250±30г). Сдавливание СН производили в верхней трети бедра (4мм выше трифуркации) под нембуталовым наркозом (40мг\кг в/б). РИР-1 вводили со следующего дня после раздавливания СН в/м ежедневно в течение 3 дней по 0.1мг/кг в/м со следующего дня после операции. После электрофизиоло- гического эксперимента забирали нерв и фиксировали от 3-х дней до недели в 10% растворе нейтрального формалина. Длительное уплотнение материала в фиксаторе дает лучшие результаты. Замороженные продольные срезы, толщиной 30-40мкм, переносили в свежеприготовленную смесь, основанную на выявлении активности Са²⁺-зависимой кислой фосфатазы (КФ) с учётом закономерности концентрационного взаимоотношения [14]. Для выявления активности фермента нами рекомендуется инкубационная смесь следующего состава: 20мл 0,40%-ный раствор уксуснокислого свинца; 5мл 1МрН 5,6 ацетатный буфер; 5мл 1% раствор Р-глицерофосфата натрия. Этот состав доводился 3% раствором хлористого кальция до метки 100мл. Инкубация проводилась в термостате при 37^о 3-4часа. После промывки срезы проявлялись в 3% растворе сульфида натрия и заключались в бальзам.

Результаты исследования

При раздавливании СН в условиях 3-х кратного введения PRP-1 макроскопически отмечается одина-ковая толщина нерва на всем его протяжении, включая место травмы, проксимальный и дистальный участки. Место раздавливания ничем не отличается от остальных отделов нерва. Морфогистохимическое изучение воздействия PRP-1 после раздавливания СН у животных, с предварительным электрофизио- логическим подтверждением восстановления прове-дения в поврежденном нерве, выявило следующее.

В течение первых 5 дней после раздавливания нерва в участке травмы наблюдается резкое падение активности КФ (рис.1а) и на фоне спада степени окрашивания нервных волокон местами обнаружи-вается несущественное изменение их направления, уменьшение плотности расположения и расслоение (рис.1А,В). Активность КФ более усилена в проксимальном отделе. В участке травмы, а также на зна-чительном протяжении в дистальном и проксимальном отделах отмечается нарушение волнообразной слоистости, присущее интактным нервам (рис.1Б). Нервные волокна в участке сдавления подвержены реактивным изменениям, в большинстве случаев они вздуты, хотя однонаправленность хода волокон почти сохранена и располагаются они параллельными рядами, характерными для нервных стволов (рис.1Г). Среди расслоенных пространств между пучками волокон прослеживаются сильно набухшие полые Шванновские трубочки с низкой активностью КФ (рис.1Д). Одновременно в участке травмы наблюдается реакция кровеносных сосудов.

Рис.1. Микрофотографии продольных срезов СН на 5-ый день после раздавливания под воздействием РЯР-1; А,В - расслоение нервных волокон; Б - отсутствие волнообразной слоистости; Г - вздутые нервные волокна (треугольник - место раздавливания с резким падением активности КФ (белые стрелки - кровеносный сосуд; черные стрелки - полые Шванновские трубочки). Ув.: 25 (а, в); 63 (А,В); 160 (Б); 400 (Г); 1000 (Д)

На 7-ой день в участке сдавления нерва обнаруживается большое количество ядер ШК и эндоневрия, что, надо полагать, связано с их пролиферацией (рис.2Б,В,Г). Ядра имеют увеличенные размеры, более округлые, расположены вразброс, содержат ядрышко и грануляции с умеренно выраженной активностью КФ (рис.2Ж). Надо полагать, что интенсивная пролиферация ШК составляет комплекс условий, благоприятствующих восстановлению нервных волокон. Как результат обменных изменений миелина нервных волокон на границе проксимального и дистального отделов нерва обнаруживаются веретеноо-бразные утолщения и нерегулярность калибра нервных волокон (рис.2Д). Следует отметить, что миелин более хрупкий, чем аксон, поэтому часто в проксимальном отделе экстензорного пучка нерва в набухших Шванновских трубочках при данных сроках уже прослеживаются аксоны (рис.2Д), а также отдельные тонкие волокна, соединяющие дистальный и прокси-мальный отделы (рис.2Е). Флексорный пучок восстанавливается значительно быстрее, хотя характерная для нерва волнообразность отсутствует и данный пучок выглядит выпрямленным (рис.2А).

2. Микрофотографии продольных срезов СН на 7-ой день после раздавливания под воздействием PRP; А— восстановление активности КФ во флексорном пучке СН (G); Б-Г — пролиферация ядер ШК и эндоневрия с умеренно выраженной активностью КФ (Ж); Д — нерегулярность калибра нервных волокон; Е — волокна, соединяющие дистальный и проксимальный отделы (треугольник — место раздавливания; черные стрелки — аксон; D — дистальный и P — проксимальный отделы раздавленного нерва; Per — n.Peroneus communis, G — n.Gastrocnemius). Увеличение: 25 (А, Б); 63 (В, Г); 100 (е); 400 (Е); 1000 (Д, Ж)

На 9-ый день наблюдается тенденция к восста-новлению волнообразности как флексорного, так и экстензорного пучков нерва и лишь на небольшом участке сдавления обнаруживаются пролиферирующие элементы эндоневрия и ШК (рис.3А,Б). Необходимо отметить, что при данных сроках активность КФ проявляется полностью и в экстензорном пучке. По ходу нервных волокон проксимального отдела наблюдаются регулярные интенсивно окрашенные вздутия, напоминающие четки, воронкообразные образования, однако между ними всегда четко прослеживается аксон (рис.3 В,Г). Характерная картина, напоминающая картину губчатой сети, возникает в результате того, что на уровне насечек Шмидт- Лантерманна, где образуются воронки Гольджи, создается плотная граница между ясными ячейками.

Спустя 17 дней после сдавления, как результат интенсивных явлений регенерации под воздействием РИР-1, обнаруживается отсутствие вздутий, благодаря сохранению периневрия и хода нервных волокон (рис.3Д). Более того, в отличие от нерва интактных крыс, волнообразная слоистость рисунка выражена значительно и впадины выглядят глубже. У всех исследуемых животных после введения PRP-1 при данных сроках обнаруживаются не более 3-4 крупных клеток, в телах которых выявляется Нотоп-положи- тельная грануляция. Ядра их круглые, большие, наиболее интенсивно окрашена околоядерная зона цитоплазмы, ближе к периферии тела активность КФ ослабевает (рис.3Е,З). Эти клетки всегда взаимосвязаны и часто трудно различить границы соседствующих клеток. Вероятно, они относятся к популяции клеток-предшественников, которые поступают с кровотоком в повреждённый орган или ткань, на месте превращаясь в нужные специализированные клетки и замещая погибшие [15]. Однако для уточнения природы этих клеток необходимы дополнительные иммуноцитохимические исследования, хотя можно с уверенностью сказать, что указанные клетки обладают высокой активностью КФ и всегда располагаются в непосредственной близости с кровеносными сосудами (рис.ЗЖ).

Рис.3. Микрофотографии продольных срезов СН на 9-ый (А-Г) и 17-ый дни (Д-3) после раздавливания СН под воздействием РЯР-1; А, Б — восстановление волнообразности нерва с пролиферирующими ядрами ШК и эндоневрия в участке раздавливания; В, Г — воронкообразные вздутия с четко прослеживаемым аксоном между ними; Д — полное восстановление волнообразной слоистости нерва (белые стрелки — аксоны; черные стрелки — группа клеток по ходу

кровеносного сосуда). Увеличение: 25 (Д, д); 63 (А, Е); 100 (а;Б); 100 (А); 160 (Ж); 400 (B,3); 1000 (Г,3)

В заключение следует отметить важный факт. При получении срезов нерва на замораживающем микротоме, вероятно, в силу своей структуры, воз-никают некоторые технические трудности, особенно у контрольных животных с нервным крашем без; Б); 100 (А); 160 (Ж); 400 (В, з); 1000 (Г, 3) фармакологического вмешательства. Часто волокна расслаиваются, нервные пучки расходятся, поэтому во избежание этого, брали маленькие кусочки нерва, примерно длиной не более 1см. В условиях введения PRP-1 срезы нерва длиной 2см на замораживающем микротоме резались очень плавно по всей длине, что, надо полагать, связано с улучшением трофики нерва под воздействием PRP-1. Таким образом, РИР-1 в ка-честве терапевтического средства проявил очевидные протекторные свойства.

Обсуждение результатов

Представляет интерес, продемонстрированный в условиях раздавливания ПН, факт значительного увеличения количества миелинизированных аксонов дистальнее участка повреждения, а в качестве фактора, противодействующего оптимальному его восстановлению, изменение направления регенерирующих моторных аксонов [10]. Другими авторами в указанных условиях показано увеличение и количества и диаметра больших миелинизированных волокон (до 80% от контрольного уровня) [16]. Согласно результатам нашего предыдущего изучения без применения протектора (контроль) [13], из проксимального и дистального участков поврежденного ПН, вплоть до 35 дня после операции, не наблюдали толстых миелинизированных волокон, а лишь тонкие с 13 дня. К тому же, к 5 и 13 дням уже обнаруживались поперечные нервные волокна, а к 25 дню в дистальном участке местами отмечались пустые поперечные Шванновские трубочки. Через 13 дней в срединном отделе травмы обнаруживалась слабая пролиферация клеток эндоневрия и ШК, а через месяц активность КФ восстанавливлась лишь в ипсилате- ральном экстензорном пучке волокон и до 70 дня не наблюдалось полного восстановления ипсилатерального флексорного пучка. Системное введение ПТГ уже на 3-и сутки после раздавливания в экстензор- ном и флексорном пучках СН выявляло пролиферацию клеток эндоневрия и ШК, а на 7-9 дни – полное восстановление активности КФ. В свою очередь, раз-витие кровеносных сосудов на 25 день сопровождалось высокой активностью КФ как в проксимальном, так и дистальном участках, но не в участке повреждения [13].

В настоящем изучении тем же методом выявления активности Са²⁺-зависимой КФ проведены срав-нительные морфо-гистохимические исследования динамики развития де- и регенеративных процессов в участке повреждения СН у крыс в разные сроки после раздавливания под воздействием РИР-1 - нейрогормона и иммуномодулятора. К 5 дню после раздавливания СН в участке травмы имелось резкое падение активности КФ, местами с несущественным изменением направления неплотно, но параллельно расположенных нервных волокон, нарушением их волнообразной слоистости, вздутием, с сильно набухшими полыми Шванновскими трубочками между ними. На 7-ой день в участке травмы обнаруживалось большое количество ядер ШК и эндоневрия, что связано с их пролиферацией, благоприятствующей восстановлению нервных волокон, характеризуемых веретенообразным утолщением и нерегулярностью калибра. В проксимальном отделе экстензорного пучка (Р) в набухших Шванновских трубочках уже прослеживались аксоны. При этом отмечалось значительно быстрое восстановление флексорного пучка G), но без характерной для интактного нерва волнообразности. К 9-ому дню наблюдалась тенденция к восстановлению волнообразности как флексорного, так и экстен- зорного пучков нерва с редкими пролиферирующими элементами эндоневрия и ШК, с полным проявлением активности КФ и в экстензорном пучке. Спустя 17 дней в результате успешной регенерации обнаруживались отсутствие вздутий, благодаря сохранению периневрия и хода нервных волокон, и значительно выраженная волнообразная слоистость. Нередко выявлялись не более 3-4 крупных тесно расположенных клеток, с Homori - положительной грануляцией, круглыми ядрами, интенсивно окрашенной околоядерной зоной цитоплазмы, по-видимому относящихся к клеткам-предшественникам с высокой активностью КФ и расположенных в непосредственной близости к кровеносным сосудам.

Для определения относительной значимости ре-зультатов настоящего исследования следует привести краткий обзор самых последних достижений в указанной области. Так, получен нейропротектор- ный эффект тестостерона на поясничные мотонейроны СМ [17] и показана роль андрогена в регуляции уровней нейритина mRNA на модели стероидом усиленной регенерации ПН, чем усиливалась аксонная регенерация и нейритный вырост в мотонейронах [18]. Более того, нейритин показан вовлекаемым в ответы как при центральных, так и периферических повреждениях и кажется общей эффектор- ной молекулой для отдельных нейротрофических и нейротерапевтических агентов [18]. Согласно самым последним литературным данным, особую роль в регенерации раздавленного ПН уделяется факторам роста и нейротрофинам. Приложение IGF-I (insulin-like growth factor) и плазмы богатой тромбоцитами на поврежденный крашем нерв ускоряет регенерацию аксона [19]. Короткой длительности низкочастотная электрическая стимуляция (ЭС), опосредуемая значительным повышением экспрессии BDNF (brain- derived neurotrophic factor) сигналов и эффектом про- миелинизации, побуждают ШК к миелинизации, что потенцировал рерост и созревание миелина в течение регенерации ПН [20, 21]. Периферическая доставка GDNF, в отличие от центральной, приводила к ранней регенерации, сопровождающей краш СН, что открывает новые возможности лечения [22]. Более того, продемонстирована дополнительная поддержка регенерации ПН последующей экспрессией GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) в GDNF- модифицированном человеческом AFMSCs (amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells) к 4 нед. [23]. Ва-зоактивный агент alprostadil может улучшить реаби-литацию нервной функции, апрегуляцией экспрессии VEGF (vascular endothelial growth factor), сопро-вождающей краш повреждение ПН [24]. Установлено, что антагонист TNF-alpha (tumor necrosis factor- alpha) поддерживает аксонную регенерацию ПН [25]. В ранних стадиях, ассоциируемых с регенерацией миелинизации ПН, NT-3 (neurotrophin 3) существенен для выживания СН [26]. Развитие кратковременного функционального восстановления СН посредством G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor) вовлекает паракринный модуляторный эффект и эффект мобилизации CD34+клетки костно-мозгового происхождения [27]. Среди других терапевтических средств для содействия регенерации поврежденного ПН следует отметить следующие. Подкреплена роль апрегуляции MHC class I в СМ в ответ на повреждение СН и доказано, что лечение IFN beta (interferon beta) повышает аксонный рост и восстановление моторной функции [28]. Доказана важная роль эндогенных глюкокортикоидов в миелинизации посредством соответствующих рецепторов в ШК после по-вреждения ПН [29]. Получена нейропротекция эритропоетином острого краш повреждения ПН, что может иметь клиническую релевантность (значимость), поскольку он был эффективен даже при введении 1 нед. спустя после повреждения [30]. В целом, результаты настоящего изучения с использованием PRP-1, а также предыдущего -с ПТГ, не уступают им. Тем не менее, и в последних вышеприведенных результатах исследований не утверждается абсолютность протекции, что создает необходимость дальнейшего поиска эффективных протекторных средств при ней-родегенерации ПН, в целом.

Список литературы

1. Минасян А.Л., Азнавурян А.В., Чавушян Е.А., Саркисян Дж.С. Вопросы теоретической и клинической медицины. Научно-практический журнал. 2008. T. 11, с. 54-62.
2. Stoll G., Muller H.W. 1999. V. 9, P.313-325.
3. Wakatsuki S., Yumoto N. et al. J. Biol. Chem. 2009. V. 284, 5, P.2957-2966.
4. Lopez-Vales R., Navarro X. et al. Brain 2008. V.131, Pt 10, P.2620-2631.
5. Roglio I., Bianchi R. et al. Neuroscience 2008. V. 155, 3, P.673-685.
6. Xu Q., Midha R., Zochodne D.W. J. Neurotrauma 2010. V. 27, 3, P.639-46.
7. Muller M, Wacker K, Getts D, Ringelstein EB, Kiefer R. Glia. 2008;56(9):1005-16.
8. Ii M., Nishimura H., Sekiguchi H. et al. Circ. Res. 2009. V. 105, 9, P.860-868.
9. Zhang P., Xue F. et al. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2008. V. 36, 2, P. 150-155.
10. de Ruiter G.C., Malessy M.J. et al. Exp. Neurol. 2008, V. 211,2, P.339-350.
11. Xu Q.G., Midha R. et al. Neuroscience. 2008. V.152, 4, P. 877-87.
12. Ribeiro-Resende V.T., Koenig B. et al. Biomaterials. 2009. V.30, 29, P.5251-5259.
13. Минасян А.Л., Азнаурян А.В., Меликсетян И.Б., Чавушян В.А., Саркисян Дж.С. Нейрохимия (РАН и НАН РА), 2010, Т. 27, 4, c.1—18.
14. Меликсетян И.Б.. Морфология (Санкт-Петерб.) 2007.Т.131,2, c.77-80.
15. Галоян А.А. Нейрохимия, 2004,Т.21, 3, c.183-189.
16. Fugleholm K., Schmalbruch H., Krarup C. J. Peripher. Nervst. 2000. V. 5, 2, P.82-95.
17. Tehranipour M., Moghimi A. Mot. Behav. 2010. V. 42, 3, P.151-155.
18. Fargo K.N., Alexander T.D. et al. J. Neurotrauma. 2008. V.25, 5, P.561-566.
19. Emel E, Ergun SS, Kotan D. et al. J. Neurosurg. 2010, in press.
20. Wan L., Zhang S., Xia R., Ding W. J. Neurosci. Res. 2010a. V. 88, 12, P.2578-2587.
21. Wan L.D., Xia R., Ding W.L. Neuroscience. 2010b. V.169,3,P. 1029-1038.
22. Magill C.K., Moore A.M. et al. J. Neurosurg. 2010. V.113,1.P.102-109.
23. Cheng F.C., Tai M.H., Sheu M.L. et al. Neurosurg. 2010. V. 112, 4, P.868-879.
24. Tang J., Hua Y., Su J. et al. Neurol. India. 2009. V. 57, 4, P.387-394.
25. Kato K., Liu H., Kikuchi S. et al. J. Neurosci. Res. 2010. V. 88, 2, P.360-368.
26. Sahenk Z., Oblinger J., Edwards C. Exp. Neurol. 2008. V. 212, 2, P.552-556.
27. Pan H.C., Wu H.T. et al.Biochem. Biophys. Res Commun.2009.V.382, 1, P. 177-182.
28. Zanon R.G., Cartarozzi L.P. et al. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2010, in press.
29. Morisaki S, Nishi M, Fujiwara H, Oda R, Kawata M, Kubo T. Glia 2010. V. 58, 8, P.954-963.
30. Elfar J.C., Jacobson J.A. et al. J. Bone Joint Surg. Am. 2008. V.90, 8, P.1644-1653.

Вопросы, ответы, комментарии