Морфо-гистохимическое изучение дегенеративных и регенеративных процессов в условиях краша седалищного нерва под воздействием яда среднеазиатской кобры NAJA NAJA OXIANA

Введение

Еще в ранних исследованиях было показано, что прорастанию регенерирующих нервных волокон содействуют даунрегуляция миелиновых генов, дедифференциация и пролиферация Шванновских клеток (ШК), которые выстраиваются в ленты Бюнгнера, проводящие регенерирующие волокна [1]. Благоприятные условия для этого создаются и в дистальной культе посредством «апрегуляции» нейротрофинов, цитокинов, адгезии молекул нервной клетки и пр. [1]. Согласно последним исследованиям выявлена роль дизинтегрина и металлопротеазы (meltrin-beta) в ремиелинизации, сопровождающей нервное повреждение, активирующей транскрипционный фактор миелинизации (Krox-20) и предшествующей дифференциации ШК [2]. Иммуногистологически также показано существенное значение пролиферации ШК после нервного повреждения для поддержки аксонной регенерации [3]. В самое последнее время представлены данные в пользу сильного воздействия секреции астроцитов на репарацию миелина [4]. Особая роль в регенерации раздавленного периферического нерва (ПН) уделяется факторам роста и нейротрофинам. Так, регенерацию аксона, поврежденного раздавливанием или крашем, ускоряет приложение к нерву IGF-I (insulin-like growth fartor) и плазмы богатой тромбоцитами [5]. В качестве дополнительной поддержки регенерации ПН служит последующая экспрессия к 4 нед. GDNF (glial ссП line-derived neurotrophic fartor) [6]. Апрегуляция VEGF (vascular endothelial growth factor), сопровождающая краш по-вреждение ПН, также способна улучшить реабили-тацию нерва, будучи активированной вазоактивным агентом (alprostadil) [7]. Далее, побуждает ШК к миелинизации, а следовательно потенцирует рерост и со-зревание миелина в течение регенерации ПН, значи-тельная экспрессия BDNF (brain-derived neurotrophic fartor), спровоцированная низкочастотной электрической стимуляцией [8,9]. Наконец, новые терапев-тические перспективы ранней регенерации создаются периферической (но не центральной) доставкой GDNF [10]. Тем не менее, представляет интерес тот факт, что не уделено должного внимания регенерации флексорного нерва в условиях краша, как эволю- ционно более новой структуры, естественно отстающей в регенерации от экстензорного нерва, в силу своей большей приверженности супрасегментарному контролю и запаздывания в развитии регегенера- тивных процессов.

В настоящей работе проведено сравнительное электофизиологическое и морфо-гистохимическое изучение динамики и степени развития нейроде- и регенеративных процессов флексорного (n.Gastrocnemius–G) и экстензорного (n. Peroneus

communis–P) нервов нижней конечности после раздавливания седалищного нерва (СН) без- и в условиях применения яда среднеазиатской кобры Naja naja ох1апа (NОХ). Ранее нами были опубликованы данные по использованию при краше СН паратиреоидного гормона [11].

Материал и методы

Эксперименты проводили на крысах-самцах Альбино (250±30г): интактных (n=7), подверженных одностороннему раздавливанию СН (контроль, п=11) и таковых в условиях применения КОХ (n=4). Раз-давливание СН производили в верхней трети бедра (4мм выше трифуркации) под нембуталовым наркозом (40мг/кг в/б). КОХ вводили со следующего дня после раздавливания СН в/м ежедневно в течение 3-х дней (5% от LD₅₀ = 1мг/кг). Все процедуры совершали согласно “правилам по уходу за лабораторными животными” (К1Н публикация за № 85-23, пересмотренная в 1985), а также особого руководства, пред-усмотренного заботой о животных и комитетом на-циональной медицинской службы и здоровья. Нерв брали в глубоком наркотическом сне через 2 часа и 5-70 дней после раздавливания и фиксировали от 3-х дней до недели в 10% растворе нейтрального формалина. Длительное уплотнение материала в фиксаторе дает лучшие результаты. Замороженные продольные срезы, толщиной 30-40мкм, переносили в свеже-приготовленную смесь, предназначенную для выяв-ления активности Са²⁺-зависимой кислой фосфатазы (КФ), с учётом закономерности концентрационного взаимоотношения [12]. Для выявления активности фермента нами рекомендуется инкубационная смесь следующего состава: 20мл 0,40 %-ный раствор уксуснокислого свинца; 5мл 1М рН 5,6 ацетатный буфер; 5 мл 1 % раствор В- глицерофосфата натрия. Данный состав доводится 3% раствором хлористого кальция до 100мл. Инкубация проводится в термостате при 37^о 3-4 часа. После промывки срезы проявляются в 3% растворе сульфида натрия и заключаются в бальзам.

Результаты исследования

При раздавливании СН в условиях введения яда КОХ макроскопически на месте травмы нерв утолщен. Морфогистохимическое изучение воздействия КОХ после раздавливания СН у животных с пред-варительным электрофизиологическим подтверждением восстановления проведения в поврежденном нерве выявило: в течение первых 3-х дней после раздавливания нерва в участке травмы наблюдается резкое падение активности КФ, наличие кровяных сгустков (рис. 1А,В). В раздавленном участке СН слабо прослеживается ход нервных волокон, однако они подвержены реактивным изменениям (рис. 1Г). Местами среди бледно окрашенных ядер клеток эндоневрия и Шванновских клеток (ШК) реагируют интенсивно окрашенные ядра (рис. 1Д). В проксимальном отделе СН фосфатазная активность значительно выше в флексорном пучке (рис. 2Б). В экстензорном пучке обнаруживаются утолщения и нерегулярность калибра нервных волокон. Не все лежащие в этих участках нервные волокна являются измененными и некоторые из них, в особенности тонкие, могут оставаться интактными (рис. 1Е).

Рис. 1. Микрофотографии продольных срезов седалищного нерва на 3-ий день после раздавления под воздействием яда NOX. Снижение фосфатазной активности в участке травмы; наличие кровяных сгустков (черные стрелки); разница в ферментной активности флексорного и экстензорного пучков СН (D – дистальный и P – проксимальный отделы краш нерва; Per – n.Peroneus communis, G – n.Gastrocnemius).Увеличение: ок.10, об. 2,5 (А ,б, д); 6,3 (В); 16 (Б); 40 (Б, Г, Д, е); 100 (Е).

На 5-ый день отмечается пролиферация клеток эндо- и периневрия, а также ядер ШК (рис. 2Б,В). Соединительнотканные клетки выявляются с светлым ядром и гомогенно окрашенной цитоплазмой. Ядра занимают большую часть тела клеток, содержат 1-2 ядрышка (рис. 2,З). Ядра ШК круглые с высокой фосфатазной активностью. Фосфатазная активность флексорного и экстензорного пучков выравнивается, оставаясь высокой (рис. 2 Е,Ж). В результате обменных изменений нервные волокна подвержены реактивным изменениям и в участке раздавливания обнаруживаются полые Шванновские трубки, в которых прослеживается аксон (рис. 2А,Г,Д). В основном их ход однонаправлен и наблюдается тенденция к восстановлению волнообразности. Ход аксона прослеживается по всей длине Шванновской трубочки, хотя местами на нем отмечаются утолщения, волнистости и бугристости (рис. 2Г).

Рис. 2. Микрофотографии продольных срезов седалищного нерва на 5-ый день после раздавления под воздействием яда NOX; А , Г, Д – набухшие нервные волокна, среди которых видны пролиферирующими клетками эндоневрия; Б, В – отсутствие волнообразной слоистости рисунка в участке травмы; Г – вздутые нервные волокна (головка стрелки –место раздавления; Per – n.Peroneus communis, G – n.Gastrocnemius; звездочка – пролиферация клеток периневрия). Ув.: ок. 10, об. 2,5 (Б); 6,3 (В); 10 (Е); 16 (Ж); 40 (А, Г, Д, З).

На 7-ой день наблюдается усиленная пролиферация ядер клеток эндоневрия и ШК (рис. 3А-Г). Нервные волокна представляют собой ось гиперпла- зического развития ядер ШК, переплетающиеся без анастомозов и сохраняющие всегда между собой отделяющие их узкие пространства (рис.3Д-Ж). Повсюду реагируют мелкие кровеносные сосуды (рис. 3 А). Обобщая патогистологическую картину при 7 дневном сроке после раздавливания следует отметить, что в аксонах наблюдается картина четок и часто обнаруживаются волокна в стадии регенерации (рис. 3 З).

Через 10 дней после раздавливания явления про-грессирующего шванноза значительно успокаиваются. Ядра ШК выглядят уплощенными, располагаются по ходу нервных волокон, хроматин фрагментирован (рис. 4Г-Е). Фосфатазная активность ядер разная. Разность в ферментативной активности наблюдается также и у нервных волокон (рис.4 З), причем в том участке, где оно утолшено и интенсивно окрашено, всегда в центре прослеживается темноокрашенный аксон (рис. 4Ж). Изредка отмечается остаточная картина вздутия волокон (рис. 4 Б). Местами среди ядер эндоневрия и ШК обнаруживаются большие круглые элементы, большей частью расположенные

Рис. 3. Микрофотографии продольных срезов седалищного нерва на 7-ой день после раздавления под воздействием яда NOX; А-З –усиленная пролиферация клеток эндоневрия и ШК; Б, В – отсутствие волнообразной слоистости СН; (головка стрелки –место раздавления; черные стрелки – кровеносные сосуды микроциркуляторного русла; белые стрелки – реактивные изменения нервного волокна ). Увеличение: ок. 10, об. 2,5 (В); 6,3 (а); 10 (В, Г); 40 (А, Б, Д); 100 (Е-З).

вокруг сосудов (рис. 4А). Вероятно, их присутствие связано с очисткой очага поражения от продуктов расщепления. В результате усиления васкуляри- зации среди нервных волокон выявляются крупные сосуды (рис. 4В).

Рис. 4. Микрофотографии продольных срезов седалищного нерва на 10-ый день после раздавления под воздействием яда NOX; А-З –умеренная пролиферация клеток эндоневрия и ШК; тенденция к восстановлению волнообразной слоистости нервных волокон, подчеркивающиеся уплощенными ядрами клеток эндоневрия и ШК (Г, Е, Ж, З); (головка стрелки –место раздавления; белые стрелки – кровеносные сосуды микроциркуляторного русла; черные стрелки – нерегулярные вздутия по ходу нервных волокон ). Увеличение: ок. 10, об. 6,3 (в); 10 (г, Д); 40 (В, Г); 100 (А, Б, Е, Ж, З).

На 17-ый день полностью восстановлена волнообразная слоистость рисунка нерва (рис. 5Е). Важно отметить, что ферментная активность распределена в пучках нервных волокон неравномерно – среди большинства волокон с умеренно выраженной фосфатазной активностью, прослеживаются интенсивно окрашенные пучки. При этих сроках флексорный и экстензорный пучки, как правило, всегда разделены широкими соединительнотканными прослойками, вероятно, в результате активной пролиферации клеток эндо- и периневрия под воздействием яда КОХ (рис. 5А-Г). Изредка обнаруживаются поперечные ветви нервных волокон (рис. 5Д,Ж), утолщенные, подвергнутые реактивным изменениям волокна (рис. 5 З). Среди восстановленных нервных волокон наблюдаются единичные экспрессивные поражения нервных волокон с дезорганизацией миелина (рис. 5И).

Рис. 5. Микрофотографии продольных срезов седалищного нерва на 17-ый день после раздавления под воздействием яда NOX; А-Г, Е – восстановление волнообразной слоистости рисунка; Д – поперечные ветви нервных волокон (белые стрелки); Ж, З – ядра ШК, расположенные по нескольким линейным контурам; К – маутнеровское пространство (черные стрелки); (звездочки – соединительнотканные прослойки между флексорным и экстензорными пучками). Ув.: ок. 10, об. 2,5 (В); 6,3 (А, Б, Д); 10 (Г); 40 (Е, И); 100 (Ж-К).

Такие фрагментарные поражения выявлены только в миелиновой оболочке, не рассеяны вдоль волокон, а встречаются изредка на коротких участках. В некоторых волокнах аксон отделен от миелиновой оболочки узким светлым маутнеровским пространством (рис. 5К). По-видимому, в качестве проявления функциональной деятельности, в этих участках наблюдаются вздутия нервных волокон, с неправильными утолщениями, появлением волнообразных изменений с фрагментацией и зернистостью. Таким образом, описанные изменения после раздавливания СН под воздействием яда NОХ дают возможность предполагать проявление регенеративных процессов в сочетании с редкой картиной перерождения отдельных нервных волокон. Гистохимические данные свидетельствуют о том, что на протяжении всей динамики изучения нерва под воздействием яда КОХ фосфатазная активность всегда отмечалась высокой.

Обсуждение результатов

В морфологическом изучении усиленная про-лиферация ядер клеток эндоневрия и ШК отмечается на 7-ой день после раздавливания, что свидетельствует о начале регенерации нервных волокон. Через 10 дней прогрессирующий шванноз значительно ослабевает и повсюду реагируют кровеносные сосуды. На 17-ый день полностью восстановлена волнообразная слоистость нерва. В результате активной пролиферации клеток эндо- и периневрия под воздействием NОХ флексорный и экстензорный пучки, как правило, разделены широкими соединительнотканными прослойками. Результаты позволяют предполагать наличие регенеративных процессов в сочетании с редкой картиной перерождения отдельных нервных волокон. Согласно гистохимическим данным, на протяжении динамики регенерации нерва под воздействием яда NОХ фосфатазная активность всегда отличалась высоким уровнем. Таким образом морфологические данные подтверждают таковые электрофизиологических. Представляет интерес оценка соотношения степени выраженности и динамики нарастания во времени вышеотмеченных депрессорных и возбудительных реакций с точки зрения успешности протекторного эффекта. Как известно, в некоторых структурах мозга в течение развития нервной системы ГАМК действует в качестве тро-фического фактора, влияющего на пролиферацию, миграцию, дифференциацию, созревание синапсов, клеточную гибель и экспрессию рецептора ГАМК(А) [13]. Недавно опубликован обзор о сложной функции тормозных синапсов в ЦНС [14]. В нем представлены многочисленные современные изучения на клеточном и сетевом уровнях доказывающие, что синаптическое торможение не может оцениваться лишь в качестве противостоящего синаптическому возбуждению и дополнительно обслуживает высоко специфические функции в нервной системе млекопитающих [14]. Согласно собственным данным, депрессорные реакции интенсивнее вовлекаются при неспецифической (периферической, центральной) и специфической нейродегенерации в различных от делах мозгах [15-17]. Протекторный эффект NOX, противодействующий в указанных условиях глубокому снижению торможения, по-видимому сводился к убыстрению восстановления возбудительных постстимульных проявлений активности МН СМ, а следовательно и проведения в поврежденных ПН. Это согласуется с высокой избирательной специфичностью и необратимостью эффектов змеиных ядов.

Продолжает оставаться актуальной необходимость дальнейшего поиска эффективных протекторных средств при нейродегенерации ПН, несмотря на интенсивные междисциплинарные исследования в указанной области. Согласно современным литературным данным, все возрастающую важность для нейропротекции приобретают яды животного происхождения, среди которых важное место занимают змеиные яды (ЗЯ). Интерес к ним обусловлен неограниченной перспективой использования ток-синов и энзимов ЗЯ, в связи с их высокой избирательной специфичностью и необратимостью эффектов, обусловливающих длительность действия, что, в свою очередь, определяет необходимость их сочетания с медикаментозными средствами [18,19]. К тому же, на основе дендротоксинов (DTX) аспидовых (семейства Elapidae), к которым относится NOX, синтезированы соединения, избирательно блокирующие некоторые подтипы потенциал-зависимых быстро- активирующихся К+ каналов в нейронах, чем контролируется их возбудимость [19,20]. Более того, на основе DTX созданы соединения, адаптивно контролирующие возбудимость поврежденных нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, чем обеспечивается, как повышение их активности (избирательная блокада подтипов потенциал-зависимых К⁺ каналов при болезни Альцгеймера), так и подавление (активаторами К⁺ каналов в качестве противосу- дорожных препаратов при эпилепсии) [19,20]. Помимо того, DTX триггируют повторный запуск в нейронах, содействуя высвобождению медиатора [21,22]. С другой стороны, характерно наличие в нейронах множественных проводимостей K⁺, чувствительных к DTX [23]. Наконец, представляет интерес NGF (neurotrophic growth factor) ЗЯ. Выявлена биоактивность NGF от ЗЯ Chinese cobra Naja naja atra, способствующего росту волокон без энзиматической, токсикологической и тератогенной активностей. В настоящем исследовании показан успешный протекторный эффект яда NOX, по-видимому связанный с NGF.

Список литературы

1. Stoll G., Muller H.W. Brain Pathol. 1999. V.9. 2. P.313- 325.
2. Wakatsuki S., Yumoto N., Komatsu K. J. Biol. Chem.2009.V.284, 5. P.2957-2966.
3. Zhang P., Xue F., Zhao F., Lu H. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2008. V3, 2, P.150.
4. Moore C.S., Abdullah S.L., Brown A. J. Neurosci. Res. 2011. V.89, 1, P.13-21.
5. Emel E, Ergun SS, Kotan D, Gursoy EB. J. Neurosurg.2010,in press.
6. Cheng F.C., Tai M.H., Sheu M.L. J. Neurosurg. 2010. V.112, 4, P.868-879
7. Tang J., Hua Y., Su J., Zhang P. Neurol. India. 2009. V.57,4,P.387-394.
8. Wan L., Zhang S., Xia R., Ding W. J. Neurosci. Res. 2010a. V.88, 12, P.2578-2587.
9. Wan L.D., Xia R., Ding W.L. Neuroscience. 2010b. V169.3.P. 1029-1038
10. Magill C.K., Moore A.M., Yan Y. J. Neurosurg. 2010. V.113, 1. P. 102-109.
11. Minasyan A.L., Aznarnyan A.V., Meliksetyan I.B., Chavushyan VA., Sarkissian J.S. Neurochemical Journal. 2011. Vol. 5. № 1. P. 52-68.
12. Меликсетян И.Б. Морфология (Санкт-Петерб.), 2007. V.131, 2, c.77-80.
13. Owens D.F., Kriegstein A.R. Nat. Rev. Neuroscience 2002.V.3, 9, P.715-727.
14. Birke G., Draguhn A. Pharmacopsychiatry 2010. V.43, Suppl.1, P.21-31.
15. Sarkissian J.S, Chavushyan V.A., Meliksetyan I., Pogho- syan M., Avakyan Z., Voskanyan A., Mkrtchian H., KamenetskyV., Abrahamyan D. New Armenian Medical Journal. 2007. V.1, P.43-56.
16. Galoyan A.A., Sarkissian J.S., Chavushyan VA.,Meliksetyan I.B, Avagyan Z.E., Poghosyan M.V, Vahradyan H.G., Mkrtchian H.H., Abrahamyan D.O. Alzheimer’s & Dement.2008. V4, 5, P.332-344.
17. Galoyan A.A., Khalaj N., Hambardzumyan L.E, Manukyan L.P., Meliksetyan I.B., Chavushyan V.A., Sarkisian VH., Sarkissian J.S. Neurochem. Res. 2010. V35, P.1747-1760.
18. Bowman W.C., Sutherland, G.A. In Kharkevich, D.A. (ed) Handbook of Experimental Pharmacology, Springer- Verlag, Berlin. 1986. P. 419-443.
19. Cook N.S. (Ed). Chichester, Ellis Horwood Ltd. 1990.
20. Rudy B. Diversity and ubiquity of K channels. Neuroscience. 1988. V25, P.729-749.
21. Harvey A.L. Gen. Pharmacol. 1997. V28, 1, P.7-12.
22. Harvey A.L. Twenty years of dendrotoxins. Toxicon 2001. V39, 1, P. 15-26.
23. Pelchen-Matthews A., Dolly J.O. Neuroscience. 1989. V29, 2, P.347-361.

Вопросы, ответы, комментарии