Регулирующим эффект галармина на уровень и активность металлопротеинов при интоксикации крыс циклофосфамидом

Циклофосфамид (ЦФ) является цитостатиком, используемым при химиотерапии онкологических заболеваний различной этиологии, для подавления роста опухолевых клеток. Однако ЦФ вызывает деградирующий эффект на нормальных клетках, по-чечную недостаточность, нарушение работы легких, подавление продуцирования эритроцитов и лейкоцитов в костном мозге, а также снижает транспорт кислорода эритроцитами, нарушает функционирование нуклеиновых кислот, В- и Т- клеток, подавляет процесс продуцирования антител в сыворотке, и оказывает иммуносупрессорную роль [1-3]. С другой стороны, ЦФ нормализует экспрессию интерлейкина (ИЛ)-12, ИЛ-4, ИЛ-5 и снижает уровень интерферона у больных мультиплетным склерозом [4]. ЦФ вызывает апоптоз СОУ434 гранулоцитов человека, который приводит к оксидативному стрессу и истощению глутатиона, подавляет активность тиоредоксин редуктазы в ткани мочевого пузыря [5,6]. В результате введения крысам 15 мг/кг ЦФ (посредством желудочного зонда 1 раз еженедельно, в течение 10 недель), наблюдается оксидативное повреждение спермы крыс, а введенная в аналогичном режиме, 35 мг/ кг липоевая кислота, оказывает антистрессорный эффект, регулируя уровень СОД, каталазы, глутатион пероксидазы и снижает степень повреждения ДНК. При этом мелатонин также оказывает протективный эффект, улучшая состояние ткани мочевого пузыря [7-8]. Известно, что одним из механизмов действия иммунной системы является нейтрализация антигенов, посредством продуцирования активных форм кислорода (АФК), которые образуются комбиниро-ванным ферментом NADPH-оксидазой, состоящей из пяти изоформ цитохрома (цит) b₅₅₈ локализованной в мембране и цитозоле иммунных клеток [9]. С другой стороны, новые 5 изоформ цит b₅₅₈ присутствуют в эритроцитарных мембранах (ЭМ) и сыворотке крови млекопитающих [10]. Причем цит b₅₅₈ ЭМ обладает NADPH зависимой супероксид-продуцирующей (О₂^-) и ферригемоглобин (ферриНb) восстанавливающей активностью [11]. Исходя из этого появляется необходимость определения О₂^- -продуцирующей и ферриИb-восстанавливающей активности цит b₅₅₈, а также уровня и активности других ключевых металлопротеинов (МП) крови, селезенки и костного мозга белых крыс при интоксикации ЦФ, что вы-зывает определенный фон оксидативного стресса. Антистрессорным, иммуномодулирующим эффектом обладает синтетический аналог богатого проли- ном полипептида (галармин), обладающий антиоксидантным и мембраностабилизирующим свойствами, за счет способности улавливания высокотоксичных для биосистем гидроксильных радикалов, которые, в частности, являются деградирующими факторами анти- и прооксидантных металлопротеинов [12-14]. Механизм действия галармина связан со стимулированием NADPH зависимой О՜- -продуцирующей и ферриНb-восстанавливающей активности изоформ NADPH оксидазы (изоформы цит b₅₅₈), локализованных на различных клеточных формированиях (в первую очередь в клетках иммунной системы), в частности в селезенке, костном мозге, а также эритроцитарных мембранах. NADPH оксидаза форми-руется и во внеклеточной среде, в частности, в сыворотке крови (экстрацеллюлярная NADPH оксидаза) при дестабилизации эритроцитов, имеющее место, в основном, при злокачественных новообразованиях. При этом изоформы КАБРИ оксидазы различной локализации являются рецепторами галармина [14,15]. Высвобождаясь из нейросекреторных гранул гипоталамуса, галармин захватывается NADPH оксидаза ми, которые локализованны на поверхностных формированиях, иммунных клеток [16-17], одним из механизмов действия которых является нейтрализация антигенов, посредством продуцирования АФК, кото-рые образуются изоформами КАБРИ оксидазы [9].

Цель работы заключалась в определении О₂^- -продуцирующей и ферриHb-восстанавливающей активности изоформ NADPH оксидазы (цит b₅₅₈), а также уровня и активности других ключевых МП крови, селезенки и костного мозга белых крыс при острой интоксикации ЦФ, в отсутствии и под влия-нием эффективной дозы галармина.

Материал и методы

Белые крысы, самцы (массой 220-250 г.) были разделены на 3 группы (по 12 животных в каждой). В опытной группе 1 (ОГ-1) крысам внутрибрюшинно вводили ЦФ по 40 мг/кг массы животного, каждый день в течение 5-ти дней, в ОГ-2 через 30 мин после введения ЦФ, также внутрибрюшинно, вводили галармин по 10мкг/кг, в течение 3 дней. В контроль-ной группе животным внутрибрюшинно вводили по 0.5мл физиологического раствора в аналогичном ре-жиме. Через 15 дней крыс декапитировали под лег-ким эфирным наркозом. Для исследований были взя-ты костный мозг (из задних конечностей), селезенка, печень и кровь (которую стабилизировали 0.2% раствором оксалата натрия). Металлопротеины про- оксидантной активности (МПА) и металлопротеи- ны антиоксидантной активности (МАА) выделяли из сыворотки крови, эритроцитарных мембран (ЭМ), из мембран клеток селезенки (МКС) и костного мозга (МККМ). МПА и МАА получали фракционированием и ионообменным хроматографированием белковых фракций на различных носителях (ДЕ-52, КМ-52,ДЕАЕ А-50, G-100) [18-20].

Получение МАА и МПА из крови

МАА (Cu, Zn- COD и каталазы) получали из промытых физраствором эритроцитов, которые далее гемолизовали в воде (1:5об/об) и после центри-фугирования гемолизата в надосадочном растворе определяли активность COD и каталазы. После ди-ализа этого надосадочного раствора против воды, центрифугирования и ионобменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЕ-52, цит b5 из этой ко-лонки элюировали 0,2 М калий фосфатным буфером (КФБ). После четырехкратного промывания ЭМ 0.04 М КФБ (1:500об/об) и далее водой и центрифугирования, МПА (изоформы NADPH оксидазы или цит b558) после их солюбилизации и диализа против воды и центрифугирования подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозе КМ-52 (для удаления следов гемоглобина), далее на целлюлозе ДЕ-52 (который также уравновешен 0.004М КФБ). Фракцию цит b558 кислого характера элюировали из этой колонки 0.4М КФБ. Из сыворотки крови экстрацел- люлярная (NADPH оксидаз) выделяли после инкубирования сыворотки в аэробных условиях при 40 в течение 3-4 дней и после диализа и центрифугирования этой сыворотки из супернатанта выделяли су- прол (супероксид-продуцирующий липопротеин высокой плотности) и экстрацеллюлярный цит b558 сыворотки (путем хроматографирования на сефадексе DEAE A-50, из которого NADPH оксидаза (цит b558) эллюировали 0.04М КФБ).

Получение МПА и МАА из клеток селезенки и костного мозга крыс

Ткань селезенки (по 2г) и костного мозга (по 0,2г) после очистки от сопутствующих липидных остатков, промывания физраствором и взвешивания гомогенировали в 0.25М сахарозе стеклянным гомогенизатором с тефлоновым пестиком (1000об/мин, 1.5 мин, при 40). Далее гомогенаты селезенки и костного мозга центрифугировали при рН-5.6. После диализа и центрифугирования в надосадочном растворе определяли активность СОД и каталазы и уровня цит С.После промывания осадков мембран клеток водой и центрифугирования (при 6000об/мин, 15мин) их снова гомогенизировали в воде. Из этих гомоге- натов далее осуществляли солюбилизацию фракций изоформ NADPH оксидазы (изоформ цит b₅₅₈). После диализа этих фракций против воды и центрифу-гирования надосадочные растворы подвергали ионо-обменной хроматографии на колонке с целлюлозой КМ-52 (для удаления следов гемоглобина), затем не задерживающиеся на этой колонке фракции (в основ-ном цит b₅₅₈) подвергали ионообменной хроматогра-фии на колонке с целлюлозой ДЕ-52 (4x10см), урав-новешенной 0.004М КФБ. Из этой колонки фракцию изоформ КАБРИ оксидазы (цит b₅₅₈ ) эллюировали 0.4М КФБ.

Определение СОД активности МАА и МАБРИ зависимой О₂^-- продуцирующей активности изоформ МАДРИ оксидаз

СОБ активность фракций, а также NADPH- зависимую O₂ ^-продуцирующую активность фракций изоформ NADPH оксидазы (изоформ цит b₅₅₈) определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом путем измерения плотности максимального оптического поглощения формазана (при 560нм), ко-торый образуется в результате восстановления НТС супероксидными радикалами О₂^-). За единицу СОБ активности принимали количество фракций, ингиби-рующих на 50% образование формазана. За единицу NADPH-зависимой О₂^- продуцирующей активности NADPHоксидаз (изоформ цит b₅₅₈ ) из крови, костного мозга и селезенки принимали количество фракций, которое вызывает увеличение уровня (плотность поглощения при 560нм) формазана на 50%.

Определение каталазной активности МАА

Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим титрованием раствора H₂O₂ в отсутствии и присутствии фракций каталазы. За единицу каталазной активности принимали количество белка, вызывающего расщепление 0.1М H₂O₂ за 1 мин при 20^o. Удельные активности белковых фракций были определены в расчете на 1мл эритроцитов или 1г ткани с объемом фракции 1мл.

Определение ферриHb-восстанавливающей активности МПА (изоформ NADPH оксидазы)

Ферригемоглобин (ферри Hb) восстанавли-вающую активность фракций и NADPH оксидазы (цит b₅₅₈) определяли путем измерения снижения плотности максимального оптического поглощения ферриНЬ (при 565нм). Это снижение прямо пропорционально образовавшемуся ферроНb (Fе²⁺ -Hb), при 555нм. При этом к 3мл раствора ферриHb (с А₅₆₅= 0.8: а-поглощение ферриНb) добавляли 0.1мл изоформы цит b₅₅₈ с А^o₅₃₀ =0.3. После суточного ин-кубирования при 36⁰ (без перемешивания раствора) наблюдается образование ферроНb. За единицу ферриНЬ восстанавливающей активности принимали количество фракций изоформ цит Ь558, которое вы-зывает снижение плотности а-поглощения ферриНЬ до 0.05, в течение часа. Количество МП определяли оптическим спектральным методом, путем изме-рения плотности характерного максимального опти-ческого поглощения для цит Ь5 при 525 нм, изоформ цит b₅₅₈ - 5 3 0нм, супрола - 430нм, церулоплазми- на - 610нм и трансферрина - 470 нм, цитохрома С -520нм. В ходе получения и очистки фракций МПА и МАА были использованы центрифуги К-70 и К-24 (“Германия”) и спектрофотометр “Specord UV-VIS” (Германия) с длиной оптического пути -1см. Стати-стическую обработку полученных результатов осу-ществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением кри-терия достоверности р.

Результаты и обсуждение

Под влиянием ЦФ в ОГ-1 оксидативный стресс обусловлен характерным изменением уровня и ак-тивности МАА и МПА крови и тканей (селезенка, костный мозг). Резкое увеличение уровня цит b₅ в 2,5 раза по сравнению с контрольными показателями (К) в цитозоле эритроцитов скорее всего обусловлено существенной потерей подвижности животных в опытной группе (табл.1), такой эффект наблюдается на на-чальных этапах гипокинезии [21]. При интоксикации циклофосфамидом механизмы существенного увели-чения (78,5%), по сравнению с контрольными пока-зателями уровня экстрацеллюлярной NADPH оксидазы (цит b₅₅₈), пока не полностью определены, есть предположение, что они ассоциированы с потерей стабильности эритроцитов, имеющее место при ин-токсикации ЦФ. При этом снижение уровня NADPH оксидазы (цит b₅₅₈) из ЭМ видимо обусловлено уве-личением степени агрегации этого гемопротеина, осложняющего процесс их отщепления (солюбилизации). Из этих соображений можно предположить, что степень агрегации цит b₅₅₈ в МКС и МККМ сни-жены, из-за чего повышается уровень отщепленного из гетерогенной фазы в гомогенную фазу фракции цит b₅₅₈. С другой стороны, заметное снижение уров-ня (А₄₃₀ нм) НАДРН-содержащего О₂^- -продуцирую-щего липопротеина сыворотки супрола (его О₂^- -продуцирующая активность не изменяется) считается положительным фактором, так как при этом сохра-няется вязкость сыворотки и в целом микроциркуля-ция крови. Под влиянием ЦФ снижается уровень сывороточного церулоплазмина (уровень трансферри- на снижен в небольших количествах), что свидетельствует о нарушении метаболизма меди, способству-ющего процессу формирования HО. - радикалов при расщеплении перекиси водорода, уровень которой заметно повышается при интоксикации крыс ЦФ. При этом процесс отщепления цит С из митохондрий селезенки существенно подавлен, в отличие от цит С из костного мозга (табл.1).

Табл.1. Уровень (плотность оптического поглощения) МПА и МАА при острой интоксикации крыс циклофос- фамидом (ЦФ) под влиянием внутрибрюшинно введенного галармина (ОИЦФ + галармин).

Число опытов 6

Достоверность р‹0,05

С другой стороны, при интоксикации ЦФ NADPH зависимая О₂^- -продуцирующая активность снижена у КNADPH оксидазы из МКС и у экстрацеллюлярной NADPH оксидазы, тогда как эти показатели, наоборот, увеличены у изоформ NADPH оксидазы из ЭМ и МККМ. При этом супероксид-продуцирующая активность другого МПА- супрола повышается на 21,2% по сравнению с контрольными показателями (К ), как это показано в табл. 2.

Табл.2. Супероксид-продуцирующая активность МПА при острой интоксикации крыс циклофосфамидом (ЦФ) под влиянием внутрибрюшинно введенного галармина (ЦФ + галармин). р‹0,05, n=6

 Число опытов 6

Достоверность р‹0,05

Табл.3. СОД-активность МАА тканей при острой ин-токсикации крыс циклофосфамидом (ЦФ) под влиянием внутрибрюшинно введенного галармина (ЦФ + галармин)

 Число опытов 6

Достоверность р‹0,05

ФерриHb-восстанавливающая активность при интоксикации ЦФ подавлена (табл. 3) в первую очередь у NADPH оксидазы из МККМ и сыворотки (на 65,8 и 60,5%), затем из ЭМ и МКС (44,8% и 48,8%, по сравнению с 100%-ными контрольными показа-телями). Это свидетельствует о существенном нару-шении кислородного гомеостаза при интоксикации ЦФ. На этом фоне активность МАА (изоформы СОД и каталазы) в цитозоле эритроцитов, клеток селезенки, костного мозга, а также в цитозоле клеток печени мало снижена под влиянием ЦФ в приведенном режиме (табл. 4,5).

Табл.4. Каталазная активность МАА тканей при острой интоксикации крыс циклофосфамидом (ЦФ) под влиянием внутрибрюшинно введенного галармина (ЦФ + галармин)

Число опытов 6

Достоверность p‹0,05

Табл.5. Ферригемоглобин-восстанавливающая активность изоформ NADPH оксидаз тканей при острой интоксикации крыс циклофосфамидом (ЦФ) под влиянием внутрибрюшинно введенного галармина (ЦФ + галармин)

Число опытов 6

Достоверность p‹0,05

Видимо это является ответом адаптационных механизмов организма против повышенного прооксидантного статуса (суммарный расчетный уровень МПА), однако этот уровень МАА видимо еще недостаточен для предотвращения оксидативного стресса при интоксикации крыс ЦФ. Как результат этого наблюдалась гибель животных в ОГ-1 (3035%). Механизмы повреждающих эффектов ЦФ связаны с резким понижением уровня и активности NADPH оксидазы из мембран клеток органа иммунной системы -селезенки. У остальных NADPH оксидаз уровень и O₂^- -продуцирующую активность изменяются неадекватным образом. Однако, в целом суммарный расчетный уровень МПА превышает такового у МАА, создавая определенный фон оксидативного повреждения клеток приведенных систем. Под действием галармина в большинстве случаев наблюдается тенденция приближения биохимических показателей к норме. Механизмы такого регулирующего эффекта галармина скорее всего могут быть ассоцированы с его способностью улавливания высокотоксичных HO.-радикалов в иследуемых биосистемах. При этом NADPH оксидазы являются рецепторами для галармина и его аналогов [16].

Следовательно можно заключить, что при интоксикации крыс ЦФ-ом галармин регулирует не только уровень МПА, но и МАА, тем самым регулируя метаболизм АФК, что в свою очередь дает предпосылки для совместного применения ЦФ с галармином при канцеротерапии.

Список литературы

1. Schellekens P.T., Ten Berge R.J. Pharm.Weekbl.Sci. 1984. 6(1). p.32-38.
2. Ten Berge R.J., Schellekens P.T. NethJ Med. 1994. 45(6). p.329-338.
3. Colvin O.M. Curr.Pharm.Des. 1999. 5(8). p.555-560.
4. Comabella M, Balashov K., Issazadeh Sh. еt al., J.Clin. Invest. 1998. 102. p.671-678.
5. Tsai-Turton M., Luong B.T., Tan Y., Luderer U. Toxicol. Sci. 2007. 98(1). p.216-230.
6. Zhang J., Ma K., Wang H. Chem.Biol.Interact. 2006. 162(1). p.24-30.
7. Selvakumar E., Prahalathan C., Sudharsan P.T., Varalakshimi P. Toxicology. 2006. 17(1). 71-78.
8. Topal T., Oztas Y., Korkamaz A. et al. J.Pinecal.Res., 2005, 38(4), 272-277.
9. Vignais P. V Cell Mol.Biol. Ci., 2002, 59(9), p.1428-1459.
10. Симонян М. А., Бабаян М. А., Симонян Г.М. Биохимия, 1995, т.60(12), с.1877-1987.
11. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. Electronic J.of Natural Sciences, 2006, 2(7), p.3-6.
12. Tavadyan L.A., Galoian K.A., Harutunyan L.A., Tonikyan H.G., Galoyan A.A. Neurochem.Res. (2010), 35(6), 947-952.
13. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Агамян Г.Р., Симонян М.А., Галоян А.А. Нейрохимия, 2007, 24(1), 37-40.
14. Алексанян М. К., Г алоян К. А., Симонян Г.М., Степанян Г.М., Симонян Р.М., Мурадян Р.Е., Алексанян С.С., Симонян М. А., Галоян А.А. Вопр.теорет.клин.мед., 2010, 13(2), 54-57.
15. Simonyan G.M., Galoyan K.A., Simonyan R.M., Simonyan M.A., Galoyan A.A. Neurochem.Res., 2011,36,739-745.
16. Melikyan N.V. Electronic J. Natural Sci., NAS RA, .(2005) 2(5). 12-14.
17. Galoyan A.A., Vartazaryan N.D., Melikyan N.V. Electronic J. Natural Sci., NAS RA, (2004). 2(3). 3-5.
18. Симонян М.А., Симонян Г.М. Способ получения металлопротеинов крови. Лицензия изобрет. N 341 Армпатента. Ереван, 1997.
19. Симонян М.А., Симонян Г.М. Способ получения ци- тохромов b из мембран эритроцитов. Лицензия изобрет. К908 Армпатента. Ереван, 2001.
20. Симонян М. А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Способ получения цитохромов b из клеточных компонентов. Лицензия изобрет. Ш233 А Армпатента. Ереван, 2008.
21. Акопян В.П., Симонян М. А., Манукян А. А., Симонян Р.М., Акопян А.А. Бюлл.эксп.биол.мед., 2001, 11, с. 527-529.

Вопросы, ответы, комментарии