Роль гемоглобина в процессе появления экстрацеллюлярной nadph оксидазы в сыворотке донорской крови и асцитной жидкости яичника женщин

В последние десятлетия опубликованы данные о существовании в жидкостях тела млекопитающих (сыворотка, плазма, слюна, моча, грудное молоко, а также асцитные жидкости различного характера) экзосомов, которые секретируются из нормальных и опухолевых клеток [1]. Эти экзосомы диаметром 30-100нм имеют мембраны и содержат многочисленные некодирующие микро-РНК, которые регулируют экспрессию гена. Они являются биомаркерами сердечно-сосудистых [2], почечных [3] заболеваний и рака простаты [4]. Экзосомы, секретируемые из тучных клеток костного мозга, стимулируют митогенную активность В и Т лимфоцитов in vitro и in vivo, усиливают процесс продуцирования цитокинов (ИЛ-2, ФНО) и являются компонентами иммунной системы [5]. Они присутствуют и в жидкости асцитной карциномы яичника женщин и играют важную роль в развитии опухолевых клеток [6]. Интересен и тот факт, что экзосомы обладают NADPH оксидазной активностью и продуцируют супероксидные и минопероксильные радикалы [7]. С другой стороны, сыворотка крови стимулирует активность NADPH оксидазы, локализованной в мембранах нейтрофилов in vitro. При этом, в самой сыворотке крови носителя злокачественного новообразования активность NADPH-оксидазы существенно повышена по сравнению с интактной сывороткой крови [810]. Фракция экстрацеллюлярной NADPH оксидазы eNox) или цитохрома b₅₅₈ впервые была выделена из сыворотки крови млекопитающих с использованием ионообменной хроматографии на целлюлозах КМ-52, ДЕ-52 и сефадексе ДЕАЕ А-50 [11]. Эндогенный уровень еNox в сыворотке крови человека резко повышается при лимфобластическом и миелобла- стическом лейкозах [12], после аэробного инкуби-рования крови крыс in vitro [13], в сыворотке крови крыс при саркоме-45 [14], при хронической интоксикации крыс ионами кадмия [15]. В приведенных патологических состояниях стабильность эритроцитов снижается, в результате чего происходит некоторый гемолиз эритроцитов и выброс Hb в сыворотку крови. При этом Hb, проникая в поврежденные участки эритроцитарных мембран (при липидной перок- сидации ненасыщенных жирных кислот этих мембран), образует нестабильный комплекс с NO в лигандном окружении геновой группы локализованного в этих мембранах цитохрома b₅₅₈ (или NADPH оксидазой - Nox). Наличие этого комплекса является чувствительным маркером дестабилизации эритро- цитарных мембран при заболеваниях различного характера, включая злокачественные новообразования и сердечно-сосудистые заболевания [16-18]. Однако к настоящему времени маханизм образования еNох в сыворотке крови млекопитающих, а также в асцитной жидкости карциномы яичника женщин еще не определен. Определение этого механизма, ассоциированного с проникающим в сыворотку крови гемоглобином является целью работы.

Материал и методы

Выделение и очистка еNох из сыворотки донорской крови человека. Следы эритроцитов и клеток плазмы из сыворотки крови были удалены путем их центрифугирования при 14000об/мин, 15мин. Сыворотку крови (10мл и выше) инкубировали в течение 4-х суток в аэробных условиях при 4^оС с электрофоретически гомогенным ферригемоглобином (2,5x10^-6, 5x10^-6, 15x10^-6М) из цитозоли эритроцитов донорской крови. После центрифугирования инкубационного раствора в приведенных условиях, в течение 15мин и разбавления супернатанта водой (20раз) еNох из этого раствора выделяли ионообменной хроматографией на колонке с сефадексом ДЕАЕ А-50 с элюированием фракции еNох 0,04М калийфосфатным буфером, pH 7,4 (КФБ). После разбавления элюата водой (20 раз) осуществляли ее ионообменную хроматографию на колонке с целлюлозой КМ-52 (для удаления следов гемоглобина и других белков основного характера). Не задерживающуюся на этой колонке белковую фракцию пропускали через колонку с целлюлозой ДЕ-52 (уравновешенную 0,004М КФБ), из которой фракцию еКох элюировали 0,04М КФБ. Далее эту фракцию еКох пропускали через колонку с сефадексом G-100, уравновешенную 0,04М КФБ, собирали и концентрировали центральную фракцию [11,17]. Жидкость асцитной карциномы яичника женщин (по шесть больных, 46-55 лет), с давностью заболевания 1,2 и 3,5 года была доставлена из онкологического диспансера г. Гюмри.

Выделение фракции вЫох из жидкости асцитной карциномы яичника женщин. Фракции еКох из жидкости асцитной карциномы яичника женщин (по 30мл), с давностью заболевания 1,2 и 3,5г, способами [11,17]. Следы эритроцитов и плазменных клеток из жидкости асцитной карциномы яичника и сыворотки донорской крови были удалены путем их центрифугирования при 14000об/ мин, 15мин. Супернатан- ты, которые имели слабо-розовый цвет у пациентов с давностью заболевания 1,2 года (с содержанием НЬ до 1.3x10^-6М) и темно красный цвет, с давностью за-болевания 3,5 года, (с содержанием НЬ до 4x10^-5М) центрифугировали в приведенных условиях и после разбавления водой (20-25 раз) фракции экстрацеллюлярной NADPH оксидазы из жидкости асцитной карциномы яичника выделяли и очищали аналогичным путем, без инкубирования асцитных жидкостей в приведенных условиях.

Определение NADPH зависимой О_2^¯ -  продуцирующей активности еNох из ЖАК и СДК. NADPH зависимую О_2^¯ -  родуцирующую активность еКох определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента образующегося формазана при 560нм в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу КАДРН зависимой О_2^¯ - продуцирующей активности изоформ еКох принимали количество белка (плотность оптического поглощения β-полосы при 530нм), которое стимулирует образование формазана на 50%. Удельная КЛОРН зависимая О_2^¯ - родуцирующая активность еNох была определена в расчете на 1мл ЖАК и 1мл сыворотки СДК.

Определение ферригемоглобин-восстанавливающей активности еNох из ЖАК и СДК. Ферри- гемоглобин (ферриНb)-восстанавливающую активность еNох из ЖАК и СДК определяли используя свежеполученный ферриНb цитоплазмы эритроцитов человека величиной плотности оптического поглощения (а полоса поглощения) при А₅₆₅=0,6 оптических единиц). Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра, к 3мл раствора ферриНЬ добавляли 0,2мл NADPH оксидаз с А₅₃₀=0,2 оптических единиц. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16ч при 30о. Далее, после повторного перемешивания реакционной смеси определяли кинетику восстановления ферриНЬ до ферроНЬ, путем измерения снижения плотности а полосы поглощения ферриНЬ при 565нм (это снижение прямо пропорционально образующемуся ферроНb при А₅₅₅). За единицу ферриНb-восстанавливающей активности КЛОРН оксидазы принимали количество белка, вызывающего снижение плотности максимального оптического поглощения а-полосы ферриНb величиной до 0,05 оптических единиц в течение часа при 20^o. Удельная ферриНb-восстанавливающая активность изоформы NADPH оксидазы была определена в расчете на 1 мл ЖАК или 1мл СДК [19]. Удельное содержание еКох было определено в расчете на 1мл белка, полученного из 1мл сыворотки или жидкости асцитной карциномы яичника женщин.

Инкубирование Hb с белками сыворотки крови in vitro для получения eNox. После аэробного инкубирования 15x10^-6M Hb из цитозоли эритроцитов человека с белками сыворотки в отдельности (альбумин, а-глобулин, у-глобулин, трансферрин, супрол [20], а также изоформы Nox из эритроцитарных мембран (ЭМ), мембран клеток селезенки (МКС), ядер клеток селезенки (ЯКС), мембран клеток костного мозга (МККМ) до 2x10^-5М в аэробных условиях in vitro в течение 4-х суток при 4^о), осуществляли выделение и очистку eNox, возможно, формирующуюся в приведенных условиях.

Определение молекулярной массы eNox. Молекулярную массы eNox из асцитных жидкостей и сыворотки крови определяли гель-фильтрационным методом на колонке с сефадексом G-100, используя в качестве маркеров цитохром С и Cu, Zn-COD из печени быка, трансферрин и церулоплазмин из сыворотки плацентарной крови женщин, каталазу из печени быка. Электрофорез белков проводили на 10% полиакриламидном геле, в течение 1,5ч. Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре “Specord UV/VIS” (Германия) с длиной оптического пути 1 см.

Статистическая обработка полученных результатов была выполнена с предварительным анализом на нормальность (Шапиро-Уилк) распределения выборок. Межгрупповые различия определялись методом параметрического анализа ANOVA, а парные линейные контрасты - при помощи теста Шеффе. Непараметрический анализ для множественных выборок с ненормальным распределением выполнен при помощи теста Краскала-Уолиса. Ранговый тест Манна- Уитни использовался для выявления различий между парными выборками.

Результаты и обсуждение

Индукция рилизинга eNox в сыворотке донорской крови под влиянием Hb in vitro. В результате аэробного инкубирования сыворотки крови человека в отсутствии и присутствии гемоглобина in vitro в выше приведенных условиях, из этих проб сыворотки выделяются 

Рис. 1. Электрофореограммы еNох (5мкг и 10мкг) из сыворотки донорской крови (1) и из асцитной жидкости карциномы яичника женщин (2)

Рис. 2. Удельное содержание eNox (плотность оптического по-глощения β-полосы 530нм): из донорской крови, без инкубирования (1) и после инкубирования Hb (до 10x10^-6М) in vitro (2), из жидкости асцитной карциномы яичника женщин с давностью заболевания 1,2 года (3) и 3,5 года (4)

Рис. 3. Оптические спектры поглощения eNox: а - в окисленном состоянии, из асцитной жидкости карциномы яичника женщин с давностью заболевания 3,5 года (1) и 1,2 года (2); после разбавления последнего 0,04 М КФБ (3) и восстановления дитионитом натрия (4). б - спектры Nox из клеточных компонентов селезенки, костного мозга и эритроцитарных мембран крыс в окисленном состоянии (на примере Nox из мембран клеток селезенки); после разбавления последнего (2) и восстановления дитионита натрия (3). Приведены характерные максимумы оптического поглощения Nox и еNoх.

Рис. 4. Изменение плотности поглощения еNох из сыворотки донорской крови человека, после инкубирования сыворотки с резличными количествами Нb при 4^о в течение 4-х дней. еМох растворены в 0.04 М КФБ.

и очищаются eNox до электрофоретически гомогенного состояния (рис.1.1), с выходом белка на 72,4±6,5 % (р=0,03). Эффективное количество Hb для формирования eNox in vitro составляет до 8,5х10^-6 М (рис. 2).

При этом, в этих условиях Hb увеличивает уровень eNox в сыворотке донорской крови в 5-6 раз (рис. 2.1, 2.2). По оптическим спектральным показателям, в окисленном и в восстановленном дитионитом натрия состояниях, полученные изоформы eNox практически не отличаются от NADPH оксидаз (Nox), выделенных и очищенных из ЭМ, МКС,ЯКС, МККМ крыс, на примере Nox из МКС (оптические спектры Nox из приведенных клеток практически идентичны с Nox из МКС и отдельно не приводятся), как это показано на рис. 3 а,б. Однако, в отличие от этих Nox на оптическом спектре eNox из сыворотки донорской крови имеется небольшое,но характерное дла eNox поглощение при 485 (рис.3 а). Эффективнoe количествo Hb для формирования eNox in vitro составляет до 8,5x10^-6 М (рис. 4). В ходе формирования eNox расходование Hb не наблюдается. После аэробного инкубирования Hb с белками сыворотки крови (альбумин, трансферрин, церулоплазмин, у-глобулин, супероксид продуцирующий липопротеин сыворотки — супрол, а также с Nox из ЭМ,МКС, ЯКС и МККМ) в результате возможной «конверсии» этих белков eNox не формируется. Полученные eNox обладают как NADPH-зависимой О2 -продуцирующей, так и ферриШ-восстанавливающей активностями [18,19]. При этом удельная NADPH-зависимая и ферриИЪ-восстанавливающая активности этих eNox на 20.2±2,1% (n=6, р=0,01) и 17,9±2,5% (n=6, р=0,03) соответственно, выше таковых у Nox из ЭМ, селезенки и костного мозга. Молекулярная масса eNox составляет 70-75 кДа.

Формирование eNox в жидкости асцитной карциномы яичника женщин in vivo. Электрофоретически гомогенные eNox также получаются по приведенной методике без аэробного инкубирования жидкостей (по 30 мл) свеженабранной асцитной карциномы яичника женщин с давностью заболевания 1,2 года (содержание Hb в жидкости уже cocтавляло до 1,3x10^-6 М) и 3,5 года (содержание Hb в жидкости еще выше и составляло до 3,0x10^-6 М) (рис.1.2). При этом содержание eNox в асцитной жидкости больных с давностью заболевания 3,5 года выше таковой у eNox в асцитной жидкости больных с давностью заболевания 1,2 года в 2-2,5 раз (рис. 2.3,4). Увелечение уровня eNox прямо пропорционально повы-шению концентрации Hb в сыворотке крови, как результат снижения стабильности эритроцитов с соответственным увеличением степени гемолиза эритроцитов при обострении болезни. Таким образом, Hb вызывает рилизинг (отщепление) eNox в сыворотке крови как in vitro, так и in vivo. По сравнению с изоформами Nox из ЭМ, МКС, ЯКС и МККМ (на примере Nox из ЭМ крыс) толерантность eNox из сыворотки крови человека или из жидкости асцитной карциномы яичника женщин против перекиси водорода намного выше (рис.5. 1,2). С другой стороны, в отличие от изоформ Nox, eNox не деградируется при ионо-

Рис. 5. Кинетические кривые снижения плотности оптического поглощения еМох из донорской крови или из асцитной жидкости карциномы яичника женщин под влиянием 2x10^-3М Н202 (1). Аналогичные показатели получаются для Мох из клеточных компонентов селезенки, костного мозга и эритроцитарных мембран (на примере Nох из мембран клеток селезенки крыс) (2). Белки растворены в 0.04 М КФБ

обменной хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-50. eNox является слабокислым гемопротеином, элюируется из колонки ДЕАЕ А-50 и ДЕ-52 0,04М КФБ, а Nox элюируются из колонки ДЕ-52 0,2М КФБ. Однако eNox в отличие от Nox необратимо деградируется (до 23%) при рН 5.

Проникновение Hb в сыворотку крови человека наблюдается при лимфобластическом и миелобла- стическом лейкозах [12] у человека, при саркоме-45 [14] у крыс, при хронической кадмиевой интоксикации крыс [15], при сердечно-сосудистых заболеваниях [21] и карциноме молочной железы [16], при инкубировании крови in vitro [13] за счет чего и формируется eNox в сыворотке крови in vivo. Каковы возможные механизмы формирования eNox?

1. Расходования Hb в ходе рилизинга (отщепления) eNox in vitro не наблюдается, что свидетельствует о том, eNox не является продуктом конверсии Hb или сывороточных белков и Nox клеток. Скорее всего Hb играет роль «скавенджера» eNox.
2. Источниками еNox, видимо, являются экзосомы, локализованные в сыворотке крови или асцитной жидкости (экзосомы не осаждаются при центрифугировании этих жидкостей в приведенных нами усливиях). Как экзосомы, так и изоформы Nox являются ключевыми компонентами иммунной системы. С другой стороны, известно, что Hb индуцирует рилизинг Nox из ЭМ в растворимую фазу, путем образования нестабильного комплекса с Nox, (с образованием нитрозоHb, за счет NO', локализованной, например, в гемовой группе Nox) [16,21,25]) при различных патологических состояниях, при которых происходит дестабилизация эритроцитов и их гемолиз [12-16]. Оптический спектр комплекса Hb с Nox мало отличается от спектра Hb и это затрудняет процесс обнаружения Nox и только после ионообменной хроматографии на целлюлозе КМ-52 происходит расщепление этого комплекса и отделение Nox от Hb, с характерными оптическими спектральными показателями. Остается предполагать, что на поверхности мембран экзосом локализована eNox, а Hb индуцирует отщепление этой eNox из экзосом и переводит ее в растворимую фазу аналогичным путем комплексообразования с нею. Экзосомы (как экстрацеллюлярные формирования) проявляют иммунномодулирующую активность, видимо, и за счет eNox [22]. Причем уровень eNox намного выше при злокачественных новообразованиях, при которых и количество эксосом гороздо выше [23].
3. Образование eNox, видимо, является ответом адаптационных систем организма при таких патологических состояниях, когда наблюдается снижение стабильности эритроцитов (выход Hb в сыворотку). Видимо, eNox играет определенную роль в процессе активации иммунной системы (eNox является более энергичным, чем другие Nox, NADPH зависимым генератором О₂^-) в экстрацеллюлярной среде и регуляции кислородного гомеостаза (eNox восстанавливает ферриHb до ферроHb или оксиHb in vivo, который уже способен перенести молекулярный кислород к клеткам [26]). В этом аспекте eNox может играть определенную физиологическую роль, особенно, при развитии злокачественного новообразования, как это имеет место для Nox из опухолевых клеток (лимфосаркома человека), а изоформы этих Nox в свою очередь, являются рецепторами нейроактивных полипептидов (пролин богатый полипептид и его аналоги) [27]. Уровень продуцируемых экстрацеллюлярной NADPH оксидазой О2- регулируется экстрацеллюларной супероксиддисмутазой [28,29].

Таким образом, у млекопитающих Hb является фактором индукции отщепления eNox в сыворотке донорской крови и жидкости асцитной карциномы яичника женщин, скорее всего, путем образования нестабильного комплекса с eNox в составе лока-лизованных в этих жидкостях экзосом с переходом eNox в растворимую фазу как in vitro так и in vivo.

Список литературы

1. Gallo A., Tandon M., Alevizos I., Illei G.G. PLoS One,2012,7(3): e 30679.
2. Zhu H., Fan G.C. Am.J. Cardiovasc.Dis., 2011, 1(2): 138-149.
3. Van Balkom B.W., Pisitkum T., Verhaar M.C., Knepper M.A. Kidney Int. 2011, 80(11): 138-145.
4. Bryant R.J., Pawlowski T., Catto J.W., Marsden G. et al. Br.J. Cancer., 2012, 106(4): 768-774.
5. Skokos D., Le panse S., Villa I., Rousselle J.C. et al. J.Immunol., 2001, 166(2): 868-876.
6. Gutwein P., Stoeck A., Riedle S., Gast D. et al. Clin .Cancer.Res., 2005, 11(7): 2492-2501.
7. M.H.Gambim et al. Critical Care 2007, 11:R107 (doi:10.1186/cc6133).
8. Theron A.J., Steenkamp K.J., Anderson R. Inflammation, 1994, 18(5): 459-467.
9. Berridge M.V., Tan A.S. Antioxid.Redox.Signal., 2000, 2(2): 231-242.
10. Ligeti E., Tardif М., Vignais P.V. Biochemistry, 1999, 22(17): 7116-7123.
11. Симонян М.А., Бабаян М. А., Симонян Г.М. Биохи-мия, 1995, 60(12): 1977-1987.
12. Симонян Г.М. Мед. Наука Армении, 2002, XLII(2): 101-103.
13. Симонян Р.М., Симонян Г.М., Симонян М.А. Мед.наука Армении, 2005, XLV(2): 26-29.
14. Симонян Г.М., Нерсесян А.К., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Симонян М.А., Галоян А.А. Нейрохимия,2005,22(2): 125-130.
15. Сираканян М.С., Симонян Г.М., Арутюнян А.А., Бабаян М.А., Симонян М.А. Вестник МАНЭБ Санкт- петербурга, 2006, 11(8): 192-197.
16. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Нер- сесян А.К., Симонян М. А. Мед.наука Армении, 2003, XLIII(2): 31-36.
17. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Способ получения металлопротеинов крови. Лицензия изобретения Армпатента No 341, Yerevan, 1997.
18. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Сте- панян И.Е., Карапетян А.В., Симонян М.А. Мед.хаука Армении, 2003, XLIII(1): 30-34.
19. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. Electronic J. Of Nat. Sci. NAS RA, 2006, 2(7): 3-6.
20. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян Р.М., Карапетян А.В. Биохимия, 1996, 61(5): 932-935.
21.  Алексанян Серг.С., Симонян Г.М., Алексанян А. С., Степанян А.А., Бабаян М.А., Симонян М.А. Мед.нау- ка Армении, 2004, XLIV (3):47-50.
22. Rupp QA.K., Rupp S., Keller S., Brase J.S. et al. Gynecol.Oncol., 2011, 122(2): 437-446.
23. Duijvest D., Luider T., Bangma S.H., Jenster G. Eur. Urol., 2011, 59(5): 823-831.
24. Kesimer M., Scull M., Brighton B., DeMaria G. et al. FASEB J. 2009, 23(6): 1858-1868.
25. Karapetyan A.V, Simonyan G.M., Anne-Frances Miller, Bert Lynn Jr., Babayan M.A., Simonyan R.M., Simonyan M.A. 227th ACS National Meeting, Anaheim, CA, 2004.
26. Della R.F., Granata A., Braccio M. et al. Anticancer Res., 1995, 15: 2089-209.
27. Simonyan G.M., Galoian K.A., Simonyan R.M., Simonyan M.A., Galoyan A.A. Neurochem.Res., 2011, 36: 739-745.
28. Tsan M.F. Int.J.Mol.Med., 2001, 7(1): 13-19.
29. Bowler R.P., Nicke M. et al. Am.J. Respir.Cell Mol. Biol., 2004, 31(4): 432-439.

Вопросы, ответы, комментарии