Окисление адреналина nadph оксидазами и изменения их активностей и форм оптических спектров поглощения In Vitro

Аналог адреналина - норэпинефрин (5мкМ) повышает супероксид (О_2¯ )-продуцирующую активность NADPH оксидазы и вызывает апоптоз вентрикулярных кардиомиоцитов в культуре этих клеток. Этот процесс подавляется скавенджером О_2¯-таурином (0,5мг/кг). Подавлением активности изоформы NADPH оксидазы (Nox)-gp91phox подавляется апоптоз кардиомиоцитов. При этом норэпи- нефрин повышает активность каплаина-1 в кардиомиоцитах. Таурин ингибирует Nох и снижает норэпинефрин- или Н₂О₂- индуцирующую активацию калпаина-1 в кардиомиоцитах. Таким образом, Nох-зависимая активация калпаина может являться важным механизмом таурина для антиапоптического эффекта кардиомиоцитов [1]. Подавление активности Кох ингибиторами (апоцинин, дифенилен йодониум) снижает индуцированную коллагеном и эпинефрином (10мкМ) агрегацию тромбоцитов из аспирин-резистентных пациентов с повышением риска сердечно-сосудистых заболеваний [2]. Ингибиторы Nох и витамин С ослабляют, а NО из эндотелия сосудов и норэпинефрин, путем активирования Кох, модулируют процесс сокращения сосудов при гипертензии у крыс [3]. С другой стороны,повышение О₂^-продуцирующей активности Nох происходит под влиянием холестерина в микросомах легких крыс в присутствии эпинефрина или цитохрома С. При этом конверсия (окисление) эпинефрина в адренахром микросомами блокируется супероксиддисмутазой, хотя активности NADPH цитохром С редуктазы и арил гидроксилазы не изменяются [4]. Однако, при инкубировании нейтрофилов с повышенными концентрациями адреналина (до 50мкМ) наблюдается, наоборот, подавление О₂ ^-продуцирующей активности нейтрофилов или локализованных в них Nох. При этом фагоцитирующая активность нейтрофилов крыс не изменяется адреналином в присутствии глюкозы или глутамина [5]. Скорее всего, в этом случае количество О₂ (для фагоцитоза) увелечивается за счет стимулирования глюкозой процесса расщепления перекиси водорода в О₂^- [6]. Таким образом, в зависимости от действующей концентрации адреналина или его аналогов NADPH зависимая О₂ ^- продуцирующая активность Nох может стимулироваться или подавляться.

Определение молекулярно-биохимических механизмов изменения О₂ ^-продуцирующей и ферригемоглобин-восстанавливающей активностей изоформ Nох из различных источников после их инкубации с различными количествами адреналина на оптическом- спектральном уровне являлось целью исследования.

Материал и методы

Выделение и очистка Кох из мембран клеток селезенки, сердечной ткани и костного мозга крыс.

Nох (NADPH оксидаза или цитохром b₅₅₈) из водных смесей мембран клеток селезенки (МКС), сердечной ткани (МКСТ) и костного мозга (МККМ), по 30г, 25г и 1,5г соответственно, выделяли и очищали лицензированным способом без использования детергента для солюбилизации указанных гемопротеинов. После промывания тканей физиологическим раствором и взвешивания, проводили их гомогенизацию в 0,25М растворе сахарозы (1г ткани в 10мл сахарозы) в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 1 мин (сердечную ткань - в течение 3 мин) при 4^оС. Клеточные мембраны осаждали дифференциальным центрифугированием. Осадок мембран промывали водой (1:50об/об) и повторно центрифугировали (10000об/мин, 10 мин). Очищенные от следов сахарозы и других сопутствующих водорастворимых солей МКС, МКСТ и МККМ смешивали с водой (1:5об/об) и повторно гомогенизировали в аналогичном режиме. После солюбилизации фракций изоформ Nох из очищенных МКС, МКСТ и МККМ, удаления нерастворимых осадков центрифугированием в аналогичных условиях и диализа надосадочных растворов против воды, для удаления следов гемоглобина или других сопутствующих белков основного характера фракции Nох подвергали ионообменной хроматографии на отдельных колонках с целлюлозой КМ-52, уравновешенной 0,004 М калий фосфатным буфером (КФБ), рН 7,4. Не задержавшиеся на колонке с КМ-52 белковые фракции далее подвергали ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЕ-52. После промывания колонки сначала водой, а затем - 0,01 М КФБ, изоформы Nох из колонки ДЕ-52 элюировали 0,2 М КФБ. После гель- фильтрации этих Nох на колонке с сефадексом G100, центральная фракция имела электрофоретически гомогенное состояние (об этом свидетельствует наличие единой окрашенной белковой полосы на 10% полиакриламидном геле) [7].

Выделение и очистка Nох из эритроцитарных мембран. nох из эритроцитарных мембран (ЭМ) выделяли путем их солюбилизации из ЭМ, диализа против воды, центрифугирования, ионообменной хроматографии супернатанта на колонке с целлюлозой КМ-52 и БЕ-52 и гель-фильтрации на колонке с сефадексом G100. В итоге получали электрофоретически гомогенный препарат NADPH оксидазы кислой природы [8].

Выделение Nох из сыворотки крови крыс. После инкубации очищенной от следов эритроцитов и плазменных клеток сыворотки крови (СК) в течение 4-х суток при 4^оС ее подвергали диализу против воды. После центрифугирования диализата (13000об/мин, 10мин) и удаления из надосадочного раствора липопротеина высокой плотности-супрола [9], повторным центрифугированием супернатанта при рН 5,6 фракцию экстрацеллюлярной NADPH оксидазы (eNox) выделяли ионообменным хроматографированием надосадочного раствора на сефадексе ДЕАЕ А-50. Из этой колонки фракцию eNox элюировали 0,04М КФБ. Далее, после разбавления элюата водой (в 20 раз) и ионообменного хроматографирования на колонке с целлюлозой ДЕ-52, фракцию eNox элюировали 0,04М КФБ. Путем гель фильтрации фракции eNox на колонке с сефедексом G100, центральная фракция имела электрофоретически гомогенное состояние. Уровень Nox определяли путем измерения характерной для Nox (цит b558) оптической плотности при 530нм (р полоса поглощения). Удельное содержание Nox из МКС, МКСТ, МККМ, ЭМ или сыворотки крови (eNox) определяли из расчета на 1мл раствора Nox полученного из 1г тканей, 1мл сыворотки и 1 мл эритроцитов.

Определение NADPH зависимой О₂ ^-продуцирующей активности изоформ Nox. NADPH зависимую О₂^- продуцирующую активность изоформ Nox определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента образующегося формазана при 560нм в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу NАДРН зависимой О2 - продуцирующей активности Nox принимали количество белка (плотность оптического поглощения β-полосы цит b₅₅₈ при 530нм), которое стимулирует образование формазана на 50%. Удельная NADPH зависимая О₂ ^-продуцирующая активность Nox была определена в расчете на 1мл эритроцитов, 1мл сыворотки или 1г тканей [10].

Определение ферригемоглобин-восстанавливающей активности Nox. Ферригемоглобин (ферри Нb)-восстанавливающую активность изоформ Nox определяли используя свежеполученный ферриНb цитоплазмы эритроцитов крыс с величиной плотности максимального оптического поглощения (a-полоса поглощения) при А₅₆₅=0,8. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра к 3мл раствора ферриНb добавляли 0,2мл Nox (цит b558) с А₅₃₀=0,3. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16 ч при 30о. Далее, после повторного перемешивания реакционной смеси определяли кинетику восстановления ферриНЬ до ферроНЬ, путем измерения снижения плотности a-полосы поглощения ферриНb при 565 нм (это прямо пропорционально количеству образующегося ферроНb при А₅₅₅). За единицу ферриНЬ-восстанавливающей активности NADPH оксидазы принимали количество белка, вызывающего снижение плотности максимального оптического поглощения a-полосы ферриНЬ величиной до 0,05 оптических единиц в течение часа при 20о. Удельную ферриНb-восстанавливающая активность Nox была определена в расчете на 1 мл эритроцотов, 1 мл сыворотки и 1 г тканей [11].

Условии проведения экспериментов. K 6мл растворам приведенных Nox и eNox (по 50мкМ), растворенных в 0,2М КФБ, добавляли по 50мкМ и по 5нМ адреналина («Sigma», США) и инкубировали при 4^о в течение 6ч. В контрольной группе проб инкубировали растворы интактных Кох и адренелина в отдельности. Далее через каждые 40мин регистрировали оптические спектры поглощения растворов этих Кох до и после добавления адреналина. К растворам (по 6мл) адреналина (50мкМ) добавляли 0,2М КФБ, инкубировали и регистрировали оптические спектры поглощения в аналогичных условиях. Во второй серии экспериментов после диализа против воды растворов Кох и еКох приведенных групп осуществляли ионообменную хроматографию на целлюлозе ДЕ-52, гель-фильтрацию на сефадексе 0100 и концентрирование на целлюлозе ДЕ-52 для удаления следов несвязанного с Nох адренохрома. Далее определяли NADPH зависимую О₂^-- продуцирующую и ферриHb-восстанавливающую активности Nох приведенных проб.

Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре “Specord UV/VIS” (Германия), с длиной оптического пути 1см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности «p ».

Результаты и обсуждение

В результате воздействия адреналина (50мкМ) с 50 мкМ электрофоретически гомогенными Кох из СК (еКох), МКСТ, МККМ, МКС и ЭМ и инкубирования при 4о в течение 6ч наблюдается определенное изменение формы и интенсивности поглощения этих Nох (рис.1).

Рис. 1. Оптические спектры поглощения Nох и eNох (50 мкМ) из: СК (eNох,), до (1) и после 6 ч инкубации с 50 мкМ адреналином при 4^о (1’), то же самое для Nох из МКСТ (2, 2'), из МККМ (3,3'), МКС (4,4') и ЭМ (5,5') до проведения ионообменной хроматографии и гель-фильтрации

Эти изменения обусловлены эффектом наложения плотности оптического поглощения Кох и адре- нохрома, как это показано на рис.2, на примере Кох из ЭМ (остальные Кох претерпевают аналогичные изменения). Однако, увеличение интесивности поглощения Nох и, особенно, еNох при 530нм (пунктирные линии на рис.1) не является эффектом аутоокисления адреналина, так как при инкубации 50мкМ адреналина с 0,2М КФБ в отсутствии Кох в аналогичных условиях образование адренохрома практически не наблюдается. Причем на начальных этапах (до 3 ч) инкубации Nох с адреналином происходит прямолинейное увеличение плотности поглощения Nох (при 530 нм).

При дальнейшей инкубации увеличение плотности поглощения Кох уже ослабляется и происходит непрямолинейно. Эти результаты свидетельствуют о том, что Кох и еКох способны окислять адреналин до адренохрома. Более того, взятым от адреналина электроном (как дополнительный источник электрона, наряду с NADPH) приведенные  NADPH оксидазы, видимо, восстанавливают О₂ превращая его в О₂^-, а последние уже способны окислять адреналин до адренохрома. Фактически это является механизмом активации Кох адреналином при продуцировании О₂^- . Причем уровень адренохрома намного выше у еNох, по сравнению с другими Nох, как это показано на табл.1.

Таблица 1. Отношение плотности максимального оптического поглощения Nох и еNох (при 530 нм) до (А_o) и после инкубации 50 мкМ Nох с 50 мкМ адреналина (А_оn) в течение 6 ч при 4^о

После ионообменной хроматографии на целлюлозе ДЕ-52 и гель-фильтрации Nох и еNох на сефадексе G100 искаженность оптических спектров этих ферментов или наложение спектров адренохрома и Кох несколько сохраняется (рис.3). Причем после ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЕ-52 адренохром не задерживается на ней, в отличие от инкубаионной смеси адренахрома с Nох, которая элюируется из этой колонки 0,4 М КФБ. Однако, даже после удаления избытка адренохрома NADPH зависимая О₂^- -продуцирующая и ферриНb- восстанавливающая активности несколько подавляются у Nох из ЭМ, МКС и МККМ, МКСТ и еNох с искаженной формой оптического спектра (рис.3, табл.2).

Однако, после инкубирования изоформ Nох и еNох (до 50мкМ) с 5нМ адреналином в течение 30 мин при 20^o, с дальнейшим ионообменным хроматографированием на целлюлозе ДЕ-52 и гель- фильтрацией на сефедексе G-100, наблюдается стимулирование NADPH зависимой О₂^- -продуцирующей и ферриНb-восстанавливающей активностей изоформ Nох (табл. 3).

Рис. 3. Оптические спектры поглощения Nох и еNох (50 мкМ) после 6 ч инкубирования с 50 мкМ адреналином при 4^о, с последующим диализом против воды, ионообменным хроматографированием на целлюлозе ДЕ- 52, гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100 и концентрирования на ДЕ-52

Таблица 2. Изменения NADPH зависимой О₂^- - продуцирующей и ферриНb-восстанавливающей активностей изоформ Nох (50 мкМ) после их инкубации с 50 мкМ адреналина при 4^о в течение 6 ч, диализа против воды, ионообменного хроматографирования на целлюлозе ДЕ-52 и гель-фильтрации на сефадексе G100 (р‹0,05, п=6)

Фактически, в повышенных концентрациях адренохром подавляет активности Nох, а в пониженных концентрациях — стимулирует их. Адренохром в определенных количествах необратимо связывается с молекулой Кох которые, видимо, являются рецепторами адреналина. Этим путем адреналин в низких количествах активирует О₂^- -продуцирующую и ферриНb-восстанавливающую активности Nох, а в избытке он подавляет их (возможно адренохром

Таблица 3. Изменения NADPH зависимой О₂^- - продуцирующей и ферриНb-восстанавливающей активностей изоформ Nох (10 мкМ) в присутствии 5 нМ адреналина (без инкубирования), (р‹0,05, п=6)

играет роль блокатора для Nох). Nох является и рецептором нейроактивного полипептида - галармина, который в определенных количествах (до10 мкг) стимулирует приведенные активности изоформ Nох [12]. Действуя подобным механизмом в соотвествующих количествах адреналин (адренохром) может стимулировать или подавлать активность иммунной системы (изофромы Кох авляются ключевыми О₂^- - продуцирующими ферментами, в частности, клеток органов иммунной системы - селезенки, костного мозга, а также кардиомиоцитов и эритроцитов), регулируя кислородный гомеостаз [13-15].

Можно заключить, что изоформы Nох из ЭМ, МКС, МКСТ, МККМ и еNох из сыворотки крови окисляют адреналин в адренохром, который способен необратимо связываться с определленным участком (доменом) молекулы Nох, вызывая характерные изменения форм оптических спектров поглощения изоформ Кох, с подавлением (при избытке адренохрома) или стимулированием (при низких количествах адренохрома) NADPH зависимой О₂^- -продуцирующей и ферриHb-восстанавливающей активностей изоформ этих Nох, которые могут считаться рецепторами адреналина.

Список литературы

1. Li Y., Arnold J.M., Pampillo М., Babwah A.V, Peng T. Free Radic.Biol.Med., 2009, 46(1): 51-61.
2. Stef G., Csiszar A., Ziangmin Z., Ferdinandy P., Veress G. Pharmacol.Rep., 2007, 59(4): 428-436.
3. Miyagawa K., Ohashi М., Yamashita S., Kojima М., Sato K., Ueda R., Dohi Y. J. Hypertens., 2007, 25(2): 415-421.
4. Ruhmann-Wenhold A., Nelson D.H. Metabolism, 1978, 27(9): 1013-1022.
5. Garcia C., Pithon-Curi T.C., de Lourdes Firmano M., Pires de Melo M., Curi R. Clin.Sci. (Lond), 1999, 96(6): 549-555.
6. Symonyan M.A. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1982, 108(4): 1751-1756.
7. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М. А. Лицензия изобрет. Армпатента, N 2233 А. Ереван, 2008.
8. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М. А. Лицензия изобрет. Армпатента, N 908. Ереван, 2001.
9. Симонян М.А., Карапетян А.В., Бабаян Н.А., Симонян Р.М. Биохимия, 1996, 61(6): 932-938.
10. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Симонян М.А., Галоян А.А. Мед. наука. Армении, 2003, XLIII(1), 30-34.
11. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. Electronic J. Natural Sci. NAS RA, 2006, 2(7): 3-6.
12. Simonyan G.M., Galoian K.A., Simonyan R.M., Simonyan M.A., Galoyan A.A. Neurochem.Res., 2011, 36: 739-745.
13. Simonyan G.M., Galoian K.A., Simonyan R.M., Simonyan M.A., Galoyan A.A. Neurochem.Res., 2011, 36: 739-745.
14. Briggs R.T., Drath D.B., Karnovski M.L., Karnovski M.J. J.Cell Biol., 1975, 67(3):566-586.
15. Vignais P.V. Cell Mol. Life Sci., 2002, 59(9): 1428-1459.
16. Simonyan R.M. Electronic J. of Natural Sciences of NAS RA, 2008, 1(10), 6-9.

Вопросы, ответы, комментарии