Исследование возможности применения фиксированных эритроцитов при аффинной очистке галектинов

Введение

Гликолизирование является одним из важнейших биологических процессов. Посредством взаимодействия с сахарами клеточных мембран осуществляются процессы деления и роста клеток, адгезии, апоптоза, канцерогенеза. Универсальным инструментом для изучения механизмов гликолизирования и изменений, обусловленных его нарушением, являются лектины. Лектины - это специфически углеводсвя- зывающие, неферментативные белки растительного и животного происхождения. К животным лектинам принадлежат галектины, специфически связывающие углеводы, содержащие остаток Б-галактозы. Галектины, как и все лектины являются агглютининами, то есть соединяют между собой мембранные углеводы двух и более клеток. Они способны идентифицировать незначительные отличия в структуре углеводов. Узнавание сахаров галектинами зависит не только от состава, но и от пространственной конфигурации и положения связи сахара, а также от окружения на клеточной мембране [2,3]. Галектины могут как стимулировать, так и ингибировать пролиферацию клеток, их адгезию к ламинину, апоптоз Т-клеток и активацию лейкоцитов [6,7,9]. Сегодня уже выявлено непосредственное участие галектинов в процессах клеточного узнавания при развитии онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваний [4,8,10]. Физиологические функции разных галекти- нов сильно отличаются друг от друга и, кроме того, один и тот же галектин может выполнять разную роль в зависимости от взаимодействующего с ним в данный момент углеводного лиганда. Поэтому главным этапом в исследовании галектинов является изучение их углеводной специфичности, позволяющей не только выяснить необходимые для максимальной аффинности особенности строения углеводного рецептора, но и определить механизм связывания с олиго- сахаридной цепью. Более того, эти исследования необходимы и для выяснения биологической роли углеводного компонента, функции которого тоже зависят от его структуры. Для изучения особенностей строения галектин-специфичных углеводных цепей необходима группа структурно родственных олигосахаридов, синтез которых сопряжен с определенными трудностями, что приводит к необходимости разработки новых методов в исследовании углеводсвязывающих возможностей галектинов.

На сегодняшний день пока еще актуальным является поиск эффективных методов аффинной очистки галектинов на их естественных природных лигандах, учитывая тот факт, что галектины проявляют большее сродство к натуральным глюкоконьюгатным лигандам, локализованных на клеточной поверхности и в экстрацеллюлярном матриксе, чем к искус-ственно синтезированным полиуглеводным носителям. Так, если с синтетическими лигандами галекти- ны связываются при высоких микромолярных и низких миллимолярных концентрациях, то с естественными лигандами - при микромолярных и субмикро- молярных количествах [5]. Помимо этого, синтез искусственных полиуглеводных носителей также со-пряжен с определенными трудностями, в частности, для связывания углеводного лиганда с носителем ис-пользуются высокотоксичные реагенты. Так как галектины являются гемагглютининами, то представ-ляется возможным их очистка с использованием эритроцитов в качестве аффинного лиганда. Ранее нами была предпринята попытка получения афинного но-сителя, где в качестве лиганда использовались групповые антигены эритроцитов человека. Однако, по-скольку галектины проявляют специфичность только к эритроцитарному В-антигену, то учитывая ограниченность в выборе лигандов и, как следствие их малое количество, метод оказался малоэффективным. Достаточно большое количество галектинспецифи- ческих лигандов обнаружено на клеточной поверхно-сти эритроцитов кролика, которые можно использовать при разработке методик по очистке галектинов. В работе описана методика получения галектинов с помощью фиксированных эритроцитов кролика.

Материал и методы

Методы получения галектинов и трипсинизации эритроцитов описаны в опубликованной нами ранее работе [1].

Приготовление фиксированных эритроцитов. 5 обьемов 50% суспензии трипсинизированных эритроцитов кролика смешивали с 5-ю объемами фосфатно-солевого буфера (0.15М натрий хлорид, 0.02М натрий фосфат, рН 7.3) и быстро добавляли 4 объема 10% формальдегида в том же буфере. Инкубировали смесь 2 часа при 37^oС, помешивая каждые 15 минут. По окончании формалинизации эритроциты несколько раз отмывали тем же буфером при низкоскоростном центрифугировании 500об/мин. Гото-вили 10% суспензию эритроцитов, консервировали 0.3% формальдегидом. Приготовленные таким способом эритроциты сохраняются при 4^oС в течение месяца.

Агглютинацию проводили следующим методом. Из трипсинизированных и фиксированных эри-троцитов готовили 4% суспензию. К 50 мкл 4% суспензии эритроцитов добавляли равный обьем раствора галектина в концентрации 0.02, 0.05, 0.1и 0.2мг/мл, инкубировали при комнатной температуре

Таблица. Зависимость агглютинации фиксированных эритроцитов от концентрации галектина и времени инкубации: Пполная агглютинация; НП-неполная агглютинация; К-контроль-нативные трипсинизированные эритроциты; Ф-фиксированные формальдегидом эритроциты

и при 37^oС от 20 минут до 2-х часов. В качестве контроля использовали трипсинизированные эритроциты при тех же условиях. Результаты оценивали визуально. Концентрацию галектинов определяли по поглощению при длине волны 280 нм.

Результаты и обсуждение

Галектины в основном получают с использованием синтетических галактозид-иммобилизованных аффинных носителей. Ранее нами разработан метод очистки галектинов с применением их естественных лигандов, нативных эритроцитов кролика [1]. Однако, обработанные трипсином эритроциты можно ис-пользовать единовременно максимум три раза во избежание гемолиза. Учитывая этот факт, была предпринята попытка получения галектинов с использованием стабилизированных формальдегидом эритроцитов. Также изучена зависимость агглютинации эритроцитов галектинами от времени инкубации и концентрации белка по сравнению с нефиксированными эритроцитами.

Как видно из таблицы, при концентрации га- лектина 0,05мг/мл, полная агглютинация фиксиро-ванных эритроцитов галектином 1 наблюдается после часовой инкубации, в то время как полная агглю-тинация обычных эритроцитов выявляется через 20 минут инкубации при концентрации белка 0,02мг/мл. Но уже при концентрации галектина 1 0,1мг/мл фиксированные эритроциты полностью агглютини-руют после 20-и минут инкубации. В случае галекти- на 3 полной агглютинации фиксированных эритро-цитов не происходит после 2-х часовой инкубации и концентрации белка 0,02мг/мл. Галектин 3 полностью агглютинирует фиксированные эритроциты через 2 часа инкубации при концентрации 0,05мг/мл и через час - при концентрации 0,1мг/мл. Кроме того, меняется картина агглютинации при обработке га- лектином фиксированных эритроцитов. Если в случае нативных трипсинизированных эритроцитов образуется единый сгусток эритроцитов, то при использовании трипсинизированных, затем фиксированных формальдегидом эритроцитов, наблюдается дискретная структура из групп эритроцитов.

Таким образом показано, что фиксированные эритроциты частично теряют способность агглютинировать под воздействием галектинов, что можно объяснить некоторым нарушением углеводного состава и структуры мембран эритроцитов при обработке формальдегидом. Однако, это не мешает использовать фиксированные эритроциты для очистки галектинов, поскольку перекрывается возможностью их более длительного использования. При очистке галектинов на обработанных трипсином эритроцитах, полученных из 5мл крови кролика, из 100гр селезенки можно единовременно выделить соответственно 1.5мг галектина 1 и 0.3мг галектина 3, тогда как при тех же условиях с использованием трипсинизированных и фиксированных формальдегидом эритроцитов получается порядка 1мг галектина 1 и 0.15мг галектина 3. Из вышеописанного следует, что фиксированные эритроциты эффективно могут быть использованы для очистки галектинов, учитывая возможность их многократного использования.

Заключение

Таким образом показано, что можно проводить очистку галектинов без применения дорогостоящих аффинных носителей, эффективно используя их естественные специфические лиганды. Стабилизация эритроцитов частично снижает их связывающую способность, однако, дает возможность многократного использования.

Список литературы

1. Давтян М.П, Геворкян Г. А. Вопр.теор. и клин. мед. 2012, 4 (71), 47-49.
2. Barondes SH, Cooper DN, Gitt MA, Leffler H. Structure and function of a large family of animal lectins, JBC, 1994, 269, 20807-20810.
3. Drickamer K, Taylor ME. Biology of animal lectins.Annu Rev Cel Biol, 1993,9,237-264.
4. Hsu DK, Yang RY, Liu FT. Galectins in apoptosis. Methods Enzymol. 2006, 417, 256-273.
5. Hirabayashi J et al. Oligosaccharide specifity of galectins:a search by frontal affinity chromatography. BBA, 2002, 1572, 232-254.
6. Leffler H et al. Introduction to galectins. Glycoconj. J, 2004, 19, 433-440.
7. Liu FT, Patterson RJ, Wang JL. Intracellular functions of galectins. BBA, 2002, 1572, 263-273.
8. Liu FT, Rabinovich GA,Galectins as modulators of tumor progression. Nat. Rev. Cancer, 2005, 5, 29.
9. Nakahara S, Raz A. On the role of galectins in signal transduction.Methods Enzymol, 2006, 417, 273.
10. Rabinovich GA, Gruppi A. Galectins as immunoregulators during infectious processes. Parasite Immunol. 2005, 27, 103-114.

Вопросы, ответы, комментарии