Исследование показателей структурно-функ­циональных характеристик биоло­ги­чес­ких мембран является информативным в оценке состояния функциональной активности клеток организма при различных эндогенных и экзогенных воздействиях. Нарушение фи­зи­о­логического состояния клетки сопровожда­ет­ся определенными пертурбациями в фосфо­ли­пи­дном (ФЛ) спектре мембран, влекущими за собой изменение функций белков мем­бран­ных структур и мембраносвязанных про­цессов. Изменением же активности мем­бра­носвязанных ферментов можно це­ле­нап­рав­ленно влиять на характер обменных процессов в клетках и тканях организма. С данной точки зрения изучение мембранных аспектов пато­ге­неза различных заболеваний является вполне актуальным и перспективным [2, 10, 11].

Как известно, одним из патогенетических звеньев при злокачественном росте является изменение функциональной активности им­муно­компетентных клеток. Вместе с тем у он­ко­ло­гических больных наблюдается ин­тен­си­фикация процессов свободнорадикального окисления, они испытывают двойную окси­дантную нагрузку, обусловленную опухо­ле­вым процессом и противоопухолевым ле­че­ни­ем. Все это приводит к повреждению мембран­ных структур клеток, вызывает в них струк­тур­ные и метаболические нарушения и обус­лов­ливает развитие выраженных местных и системных токсических реакций [11]. При злокачественном перерождении наблюдаются существенные сдвиги и в метаболизме мем­бран­­ных ФЛ: накопление плазмалогенов, алки­ла­цильных фосфатидов, понижение актив­нос­ти лизофосфолипазы Д, отсутствие ферментов метилирования фосфатидилэтаноламина [5]. Наряду с этим выявлена [9, 20] селективная противоопухолевая активность некоторых ФЛ, их галоген- и тиопроизводных. Установлено [1, 4, 10] нарушение деятельности некоторых мем­браносвязанных ферментов при многих онко­гематологических заболеваниях.

Целью настоящей работы явилось иссле­до­вание активности мембраносвязанной 5´-нуклеотидазы, Mg- и Ca-АТФазы, а также ФЛ лим­фоцитов периферической крови при опу­хо­левом заболевании лимфатической системы – лимфогранулематозе (ЛГМ).

Материал и методы. Под наблюдением в Гематологическом центре им. проф. Р.О. Еоляна МЗ РА находились 22 больных ЛГМ. В исследованиях использовались лимфоциты периферической крови, полученные методом дифференциального центрифугирования в гра­диенте плотности фиколл-верографина.

Общие липиды экстрагировались из аце­то­новых порошков лимфоцитов крови больных (до начала терапии) в смеси растворителей метанол: хлороформ (1:2). Фракционирование ФЛ осуществляли методом тонкослойной хро­ма­тографии в модификации Казаряна П.А. [3] на закрепленном слое силикагеля марки ЛС (Чехия). Для разделения использовали сис­тему растворителей хлороформ – метанол – вода (65:25:4). В каждой фракции определяли со­дер­жание липидного фосфора [6], а количество ФЛ выражали в мг Фн/г ткани.

Активность Ca-АТФазы определяли по разнице между общей и Mg-АТФазной актив­ностями [17]. Оценку 5´-нуклеотидазной ак­тив­ности осуществляли по методу Muszbek et al. [15]. Изменение АТФазной и 5´-нуклеоти­даз­ной активности регистрировали по при­рос­ту неорганического фосфора в инкубационной среде, а активность выражали в микромолях Фн/ч/мг белка. Содержание белка в пробах опре­деляли по методу Lowry et al. [12]. Ста­тис­тическая обработка полученных данных проводилась с учетом критерия достоверности Фишера-Стъюдента.

Результаты и обсуждение. Результаты ис­сле­дований показывают, что ЛГМ сопровож­да­ется значительными изменениями индивиду­аль­ных ФЛ лимфоцитов (рис. 1). Так, выяв­ле­но статистически достоверное (р<0,01) повы­ше­ние доли сфингомиелинов (СМ), дифосфа­ти­дилгли­це­ринов (ДФГ) и лизофосфатидилхо­ли­нов (ЛФХ) (приблизительно в 1,4; 1,85 и 1,3 раза соответственно). Несомненно, что увели­чению содержания последних способствует понижение количества фосфатидилхолинов (ФХ) (в 1,76 раз) вследствие повышения ак­тив­ности фосфолипаз, в частности фос­фо­ли­па­зы А2. Повышенное содержание ЛФХ обос­но­вывается его особой физиоло­ги­чес­кой ролью в тканях: усиление клеточной про­ли­фера­ции, стимуляция адгезии и диф­фе­ренцировки лимфоидных клеток, активация мак­ро­фагов и Т-лимфоцитов, инициация хемо­таксиса моноцитов, модуляция агрегации тромбоцитов [13].

Рис. 1. Изменение спектра мембранных ФЛ в лимфоцитах крови больных ЛГМ (в % от суммы)

Обнаруженное нами статистически дос­то­верное увеличение доли ДФГ, играющих важ­ную роль в иммунологическом ответе лим­фо­цитов, на фоне уменьшения основного компо­нен­та фосфолипидного пула - ФХ, на наш взгляд, объясняется развитием компен­са­торно-приспособительных механизмов, на­прав­лен­ных на поддержание стабильности био­мем­бран за счет взаимодействия ДФГ с белковыми ком­понентами.

Учитывая существование модификацион­ных механизмов взаимопревращения фос­фа­ти­­дилсе­ринов (ФС), фосфатидилэтаноламинов (ФЭ) и ФХ, обеспечивающих перераспреде­ле­ние азотистых оснований и жирных кислот в ли­пи­дном бислое (декарбоксилирование ФС и метилирование ФЭ), можно предположить, что уменьшение количества ФС частично связано с вовлечением их в реакции синтеза по схеме ФС↔ФЭ↔ФХ. Однако имеющиеся литератур­ные данные [5] указывают на отсутствие ФЭ-метилтрансфераз у онкологических больных. Подтверждением этому являются данные об относительно высоком (стабильном) содер­жа­ние ФЭ лимфоцитарных мембран в нашем ис­сле­до­вании (рис. 1).

Наблюдается увеличение содержания фосфатидилинозитолов (ФИ) и фос­фатидных кислот (ФК), являющихся, как известно, Ca2+-ионофорами и играющих су­щест­венную роль в регуляции концентрации каль­ция в мембранах. Между тем аккум­уля­ция кальция за счет повышения уровней ФИ и ФК может явиться своего рода пусковым звеном активации Ca2+-зависимой внутрикле­точ­ной сигнальной системы, обуславливающей действие митогенов и факторов роста, а также ФС-зависимой протеинкиназы С [7]. Сущест­ву­ет мнение [19], что инозитфосфатиды могут функционировать как супрессоры ДНК-поли­ме­разы, что указывает на опосредованное вли­яние ФИ на формирование ракового генотипа.

Заслуживает внимания заметное увели­че­ние уровня СМ (в 1,4 раза), которые, согласно современным представлениям, играют су­щест­вен­ную роль в злокачественном росте, осу­ществляя контроль над процессами развития, дифференцировки, активации и программной гибели лимфоцитов [2,13].

В результате совершающихся качественных и количественных изменений мембранных ФЛ, главным образом фосфатидов-глицеридов, обес­­пе­чи­вается определенная текучесть мембраны, а изменение последней приводит к раз­витию конформационных нарушений мем­бран­ных протеинов, вследствие чего воз­мож­ны существенные отклонения в активности мембраносвязанных ферментов и рецепторных белков. Так, наблюдается почти двукратное (р<0,001) снижение активности одного из биохимических маркеров плазматической мем­бра­ны – 5´-нуклеотидазы. Регистрируется по­дав­ление общей АТФазной активности (в 1,4 раза по сравнению с нормой) со значительным (р<0,01) угнетением деятельности Mg- и Ca-АТФаз (на 25,81 и 38,11% соответственно). Возможно, накопление ионов кальция в лим­фо­цитах (вследствие пониженной активности Ca-АТФазы), являющихся стимулирующим фактором свободнорадикального окисления ли­пидов и фосфолипазного гидролиза на уровне мембранных систем клетки, способно мо­дули­ровать проницаемость мембран, приводя к внутриклеточным потерям ионов калия.

Рис. 2. Изменение активности мембраносвязанных ферментов в лимфоцитах при лимфогранулематозе (в мкмолях Фн/мг белка)

Как известно [18], активность 5´-ну­клео­тидазы регулируется состоянием текучести наружного слоя мембраны (ФХ/СМ). Подав­ление активности фермента, несомненно, обус­лов­лено ригидностью наружного слоя мем­бра­ны в лимфоцитах при данной патологии. С другой стороны, снижение активности 5´-нуклеотидазы, связанной с мембраной гидро­фоб­ным гликозилфосфоинозитольным яко­рем, вероятно, происходит в результате уменьшения процентного содержания ФИ-компонента под действием фосфолипазы С (р<0,05), приводящего к солюбилизации фермента с поверхности мембраны. Между тем 5´-нуклеотидаза, являясь интегральным белком плазматической мембраны, выступает не только в роли маркера клеточной дес­трукции, но и участвует в пуриновом мета­болизме, играющем, как известно, важную роль в функционировании лимфоцитов [8]. Ли­те­ратурные данные свидетельствуют о прог­ностическом и диагностическом характере из­ме­нения активности ферментов пури­н­нукле­отидного обмена при лимфопролифератив­ных заболеваниях различной этиологии: хрони­чес­ком лимфолейкозе, лимфомах, множественной миеломе [14,18].

Таким образом, снижение 5´-нуклеотидаз­ной и АТФ-азной активности при лимфограну­ле­ма­тозе в совокупности с изменением харак­тера ФЛ-ФЛ соотношений может явиться следст­вием нарушения физико-химических ха­рак­теристик лимфоцитарных мембран, что, несомненно, отражается на функциональной активности лимфоцитов в целом. Следо­ва­тель­но, можно заключить, что исследование ука­зан­ных биохимических показателей, харак­тери­зующих состояние мембран лимфоцитов, является достаточно информативным для оценки характера изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток и служит прогностическим и диагностическим критерием при определении степени повреж­де­ния клеток иммунной системы у онкоге­ма­то­логических больных.

Литература

1. Дагбашян С.С., Пепанян А.А., Казарян П.А. и др. Оценка липид-белковых и липид-ли­пид­ных взаимоотношений при агрессивных не­ход­жкинских лимфомах. Новое в гем. и трансфуз., Киев, 2006, 5, 165-169.
2. Дятловицкая Э.В., Кандиба А.Г. Роль био­ло­ги­чески активных сфинголипидов в зло­ка­чест­вен­ном росте. Биохимия, 2006, т. 71, 1, с. 17-26.
3. Казарян П.А., Элоян Д.В. Хроматогра­фи­ческие методы. М.: ЦОЛИУВ, 1982, 40 с.
4. Пепанян А.А., Саакян Л.С., Казарян П.А., Симонян Л.Г. Изменение активности мембра­носвязан­ных ферментов при острых лейкозах. Мат. III конгресса онкологов закавказ. гос., 2004, Ереван, с. 193-194.
5. Саблина М.А., Ушакова И.П., Серебренни­ко­ва Г.А. Хим. фарм. ж., 1993, 6, с. 3-13.
6. Светашев В.И. Микротехника анализа липи­дов и ее использование Автореф. дис. ... канд. хим. наук, Владивосток, 1973, 25 с.
7. Слюсарь Н.Н. Роль фосфоинозитидов и их метаболизм в онкогенезе Автореф. дис. .... докт. мед. наук, СПб., 30с.
8. Тапбергенов С.О., Тапбергенов Т.С. Фер­мен­ты метаболизма пуриновых нуклеотидов в оцен­ке функциональной полноценности им­му­ни­тета. Биомед. химия, 2005, т. 51, 2, с. 199-205.
9. Ahmad I., Filep J.J., Frankim J.C. et al. Cancer Res., 1997, 57, 1915-1921.
10. Ghazaryan P.A., Danelyan S.H., Sahakyan L.S. et al. Metabolism of biomembrane components at leukemia and during specific therapy, 29th Ann. Meet. of the Europ. Group Blood and Marrow Transpl., Turkey, 2002, p. 733.
11. Karageuzyan K.G. Oxidative stress in the molecular mechanism of pathogenesis at diffe­rent diseased states of organism in clinics and experiment, Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy, 2005 Feb; 4(1): 85-98.
12. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. Protein measurement with the folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 1951, 193(1): 265-275.
13. Martinova E.A. Influence of sphingolipids of T lymphocyte activation, Biochemistry (Moscow), 1998, 63(1): 105-113.
14. Mesarosova A., Hrivnakova A., Babusikova O. A comparison of some leukocyte differentiation markers and the adenosine deaminase and purine nucleotidase phosphorylase values in B and T cell leukemias and lymphomas, Neoplas­ma, 1995, 42, 6, p. 307-312.
15. Muszbek L., Szabo T., Fesus L. Analyt. Biochem., 1977; 77: 286-288.
16. Prokazova N.V., Zvezdina N.D., Korotaeva A.A. Effect of lysophosphatidylcholine on trans­mem­­brane signal transduction, Biochemistry (Moscow), 1998, 63(1), p. 32-39.
17. Ratbun W.B., Betlach M.V. Estimation of enzy­mi­cally produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate, Analyt. Biochem., 1969; 28(1): 436-445.
18. Rosi F., Tabucchi A., Carlucci P. et al. 5’-nucle­tidase activity in lymphocytes from pati­ents affected by B-cell chronic lymphocytic leu­ke­mia, Clin. Biochem., 1998 Jun, 31(4): 269-272.
19. Shoji-Kawaguchi M., Izuta S., Tamiya-Koizumi K. et al. J. Biochem. (Tokyo), 117(5), p. 1095-1099.
20. Winkelmann M., Ebeling K., Strohmeyer G et al. J. Cancer. Res. Clin. Oncol., 118, 6, p. 405-407.