Cоотношение возбудительных и депрессорных синаптических процессов в нейронах гиппокампа, амигдалы и ядра Мейнерта в динамике развития болезни Альцгеймера на модели, индуцированной Аβ 25-35

Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, гиппокамп, амигдала, я. Мейнерта, одиночная спайковая активность.
Представлены доказательства токсического разрушительного воздействия растворимых олигомеров Aβ на межклеточные нейротрансмиттерные сигналы, ведущие к редукции синаптической интеграции [7]. Однако неизвестно инициируют ли они торможение синаптической пластичности, потерю синапсов и гибель нейронов при болезни Альцгеймера (БА) [11]. Согласно гипотезе «амилоидного каскада» в гиппокампе (Г) и коре мозга с возрастом, неравномерное распределение продукции и/или очистки Aβ приводит к ее аккумуляции и аггрегации, cодействующей нейродегенеративному каскаду с оксидативным стрессом, повреждением и потерей нейронов [6]. Показано, что олигомерные и фибриллярные формы Aβ вызывают нарушение длительной потенциации, синаптическую дисфункцию и ускоряют формирование нейро-фибриллярных нитей [11]. Полагается, что активация компенсаторных механизмов не только способна сдерживать развитие патологического процесса, но может быть использована для профилактики и лечения БА. Компенсаторные механизмы включают образование антител к β-амилоиду, синтез нейропротекторных белков, активацию антиоксидантных систем и проонкогенов, тормозящих апоптоз, индукцию нейрогенеза, спраутирование терминалей нейронов, увеличение «плотности» рецепторов нейромедиаторов. Даже процесс образования бляшек может носить компенсаторную функцию, поскольку снижает уровень наиболее токсичных протофибрилл Аβ. Однако, с возникновением клинических признаков компенсаторные механизмы, как правило, истощены. В частности, снижение ингибиции в гиппокампе крыс могло быть следствием селективной потери ГАМКэргических нейронов [13]. К тому же, нейрогенез в зрелом мозге также находится под ГАМКэргическим контролем [2].  Представляет интерес тот факт, что Г способен в течение всей жизни генерировать новые нейроны благодаря кортикостерону – наиболее мощному из содействующих этому факторов [14]. Более того, новые нейроны развивают свойства функциональных нейронов, способность запускать потенциал действия и обретать синаптические входы с вовлечением в нейрональные сети [5]. В заключение, согласно модели функциональной роли зрелого нейрогенеза в механизмах памяти: а) новые нейроны могут разрушить существующую нейрональную сеть с целью формирования новых синаптических кругов, c потерей предшествующей памяти; б) интеграция новых нейронов в нейрональную сеть, для замещения погибших, может обеспечить консолидацию памяти; и в) новые нейроны могут усиливать длительную потенциацию либо повышением числа синапсов, либо подавлением ГАМКэргических входов в перфорантный путь [8]. Дальнейшие изучения относительно модуляции Aβ-индуцированных модификаций синаптической функции и пластичности нуждаются в оценке роли адаптивных изменений с учетом противоречивых данных [12]. Целью исследования явилось изучение механизмов развития синаптических процессов в структурах первичной-третичной памяти мозга, в качестве синаптической потенциации и депрессии, на амилоидной модели БА.

Материал и методы

Эксперименты проводили на 17 половозрелых крысах–самцах Альбино, массой 200–250 гр., в 2 сериях экспериментов: 1. на интактных (n=8); 2. на модели БА, индуцированной билатеральным ИЦВ Аb 25–35 (n=15). Проведено изучение активности нейронов Г, амигдалы (Ам) и ядра Мейнерта (ЯМ) на высокочастотную стимуляцию (ВЧС) энторинальной коры мозга (ЭК) и Г. Все эксперименты проводили согласно «правилам ухода за лабораторными животными» (публикации NIH за № 85-23, исправленной в 1985 году). Для создания модели БА билатерально интрацереброветрикулярно инъицировали токсический олигомер Аβ 25-35 согласно координатам стереотаксического атласа [9] (АР–1, L±1.5, DV+3.5 мм) по 3 мкл 10–9 М фрагментов Аb 25–35 (1 мг/мл при t 37°С, агрегированного в течение 4 дней) [Maurice, 1998] и выдерживали до острого эксперимента 12-28 нед. Операции проводили под пенто¬барбиталовым наркозом (40 мг/кг, в/б), операционное поле обрабатывали 0,1 % Бицилином. В остром опыте животных дополнительно обездвиживали 1% дитиллином (25 мг/кг в/б) и переводили на искусственное дыхание. После краниотомии, стереотаксически ориентированный раздражающий электрод вживляли в ипсилатеральную ЭК (АР–11, L±3.5, DV+4.0 мм) и Г (АР–3,5, L±2.0, DV+4.0 мм), а стеклянный отводящий микроэлектрод с диаметром кончика 1 мкм, заполненный 2М раствором NаCl, погружали в Г (АР–3.5, L±2.0, D+4.0 мм), Ам – Rostral amygdalopiriform area (АР–3.24, L±5.4-5.8, DV+9.5-10.2 мм) и ЯМ (АР–1.8, L ± 3.0, DV+7.4 мм). В целом, была зарегистрирована активность 876 нейронов: из Г (236), Ам (382) и ЯМ (258). ВЧС (100 Гц в течение 1 сек) ЭК и СА1 Г осуществляли посредством прямоугольных толчков тока длительностью 0,05 мс и силой 0.10–0.16 и 0.16–0.18 мА.

Проводили программный математический анализ одиночной спайковой активности нейронов Г (31), Aм (89), ЯМ (80) в норме и на модели БА нейронов Г (205), Ам (293), ЯМ (178). Оn-line регистрацию производили на основе программы, обеспечивающей селекцию спайков посредством амп¬литудной дискрими¬нации, с последующим выводом «растеров» пре- и пост¬стимуль¬ного спайкинга от множества нейронов, а также диаграмм усредненной частоты спайков (разработчик В.С. Каменецкий). Им¬пульс¬ный поток после селекции подвергался программному математическому ана¬лизу. Для изби¬раемых сравниваемых групп спайкинга нейрональной активности строили суммированные и усредненные перистимульные (РЕТН Average) гистограм¬мы и гистограммы частоты (Frequency Average). Для определения статистической достоверности различий в длительности межспайковых интервалов до и после действия стимула использовался непараметрический критерий проверки однородности двух независимых выборок - двухвыборочный критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (Wilcoxon-Mann-Whitney test). Так как число регистрируемых спайков было достаточно велико (до нескольких сотен спайков за 20 секундный интервал после действия стимула), использовалась разновидность указанного теста, учитывающая  его асимптотическую нормальность – z-тест. Сравнение критических значений с табличными значениями нормального распределения при уровнях значимости 0.05, 0.01 и 0.001 (для различных испытаний), показывает, что в результате ВЧС для большинства выборок спайкинга нейрональной активности имеется статистически значимое изменение как минимум с уровнем значимости 0.05.

Результаты исследования и обсуждение
 
Сравнительный анализ импульсной активности одиночных нейронов Г, Ам и ЯМ в норме (n=200) и на модели БА спустя 12-28 нед (n=676) выявил формирование возбудительных и депрессорных ответов в нейронах Г и Ам на ВЧС ЭК, нейронов Ам и ЯМ на ВЧС Г, в виде тетанической потенциации (ТП) и депрессии (ТД), с последующими посттетаническими смешанными одно-и разнонаправленными проявлениями активности в виде ПТП и ПТД, исчисляемых на основе усредненного количества спайков (PETH) с пересчетом в межимпульсные интервалы и частоты в Гц (Frequen¬cy Average).

По сравнению с престимульным уровнем депрессорные постстимульные проявления активности нейронов Г на ВЧС ЭК выявлялись в следующих пределах. Спустя 12 нед  после введения Аβ 25-35 тетаническая депрессия в депрессорной последовательности исчислялась в пределах 3-кратного занижения престимульной активности, равного норме (3-кратного), в депрессорно-возбудительной последоватеьности – выше нормы порядка 4-кратного; спустя 15-16 нед ТД нейронов Г в ТД ПТД достигала 3-кратного занижения, равного норме; через 28 нед – 4-кратного занижения, выше нормы (Рис. 1 А). ТД в ТД ПТП спустя 12 нед определялась порядка 4-кратного занижения, выше нормы (3-кратного) и 3-кратного - через 15-16- и 28 нед, равного норме (Рис. 1 Б). Спустя 12 нед ТД в ТД ПТД нейронов Ам на ВЧС ЭК исчислялась в пределах 23-кратного занижения, в то время как в норме она достигала 4.25-кратного, т.е намного ниже, а в ТД ПТП – 22-кратного, также выше нормы (10-кратного) (Рис. 1 В, Г). В нейронах Ам на ВЧС Г спустя 12, 13, 16 и 18 нед ТД в ТД ПТД определялась порядка 3.5-, 2-, 3- и 3-кратного занижения, соответственно, что оказалось преимущественно выше нормы (2- кратного); ТД в ТД ПТП – в пределах 3-, 1-, 2- и 2-кратного занижения, соответственно, что в сравнении с нормой (2-кратного), сначала превысила ее, затем достигла уровня нормы (Рис. 1 Д, Е). Наконец, в нейронах ЯМ на ВЧС Г ТД в ТД ПТД спустя 12 нед достигала 2.5-кратного занижения, через 22 нед 2-кратного уровня, спустя 28 нед – 2.5-кратного, что в сравнении с нормой (4-кратного), с удлинением срока испытания так и не превысила ее; ТД в ТД ПТП спустя 12-, 22- и 28 нед достигла значений 2.5-, 2- и 3-кратного, соответственно, с той же тенденцией пргрессии во времени, но уже с превышением нормы (порядка 2-кратного) (Рис. 1 Ж, З). Таким образом, в соответствующих посттетанических последовательностях тетанические депрессорные процессы в нейронах Г на ВЧС ЭК нарастали с удлинением сроков испытаний, превышая норму и приравниваясь к ней, с значительным превалированием в нейронах Ам на ВЧС ЭК, с относительно низким превалированием  и приравниванием к норме на ВЧС Г и ниже и выше нормы в нейронах ЯМ на ВЧС Г (Рис. 1).

Возбудительные постстимульные тетанические реакции (Рис. 2) изменялись следующим образом. ТП в возбудительной последовательности (ТП ПТП) в нейронах Г на ВЧС ЭК спустя 12 нед после введения Аβ 25-35 достигла превышения престимульного уровня 8.5-кратно, что оказалось намного выше нормы (3-кратно), через 15-16 и 28 нед превышение престимульного уровня определялось в пределах 2  и 1 раза, соответственно, что было ниже нормы; ТП в возбудительно-депрессорной последовательности (ТП ПТД) в указанные периоды испытаний достигла 3-, 2.25- и 3-кратного превышения,

Рис 1. А-З – комплексные усред¬ненные перистимульные (PETH Average) и гистограммы частоты (Frequency Average) постстимульной тетанической депрессорной спайковой активности нейронов гиппокампа (А, Б), амигдалы (В-Е) и ЯМ (Ж, З) на ВЧС ЭК (А-Г) и гиппокампа (Д-З), в сравнении с нормой (А-З) на модели БА. Остальные обозначения в рисунке.

Рис. 2. А-З – комплексные усред¬ненные перистимульные (PETH Average) и гистограммы частоты (Frequency Average) постстимульной тетанической возбудительной спайковой активности нейронов гиппокампа (А, Б), амигдалы (В-Е) и ЯМ (Ж, З) на ВЧС ЭК (А-Г) и гиппокампа (Д-З), в сравнении с нормой (А-З) на модели БА. Остальные обозначения в рисунке.

соответственно, намного ниже нормы (12.5-кратного) (Рис. 2 А, Б). В нейронах Ам на ВЧС ЭК через 12 нед ТП в ТП ПТП исчислялась в пределах 10.25-кратного превышения, выше нормы (9.4-кратно); ТП в ТП ПТД достигла 14-кратного превышения, соответственно, намного выше нормы (2.14-кратного) (Рис. 2 В, Г). В нейронах Ам на ВЧС Г 12 нед спустя ТП в ТП ПТП выявлялась порядка 1.43-кратного превышения, 13 и 16 нед спустя - 1.5-кратного превышения, через 18 нед – 3-кратного, что было несколько выше нормы (2.66- кратного); ТП в ТП ПТД в те же сроки исчислялась в пределах 1.14-, 1-, 1- и 1-кратного,соответственно, что оказалось намного ниже нормы (3-кратного) (Рис. 2 Д, Е). В нейронах ЯМ на ВЧС Г ТП в ТП ПТП через 12, 22 и 28  нед исчислялась в пределах 1.1-, 1.2- и 1.5-кратного превышения, не достигая нормы (2-кратного); ТП в ТП ПТД в те же сроки – достигала 1.5-, 1.33- и 1.5-кратного превышения приближаясь к норме (1.5-кратного) (Рис. 2 Ж. З). Иными словами, в нейронах Г на ВЧС ЭК возбудительные тетанические эффекты через 12 нед оказались в обеих последовательностях значительно выше и ниже нормы, соответственно, через 15-16 и 28 нед – превышение достигало уровня ниже и намного ниже нормы в тех же последовательностях. В нейронах АМ на ВЧС ЭК через 12 нед ситуация оказалась обратной – с незначительным превышением и намного выше нормы. В нейронах Ам и ЯМ на ВЧС Г, в целом, изменения определялись в незначительных пределах. В АМ на ВЧС Г ТП в возбудительной последовательности, будучи ниже нормы к 12, 13 и 16 нед испытаний, несколько превысила ее к 18 нед, а в смешанной – на все время испытаний так и не достигла нормы. Наконец, в нейронах ЯМ на ВЧС Г от 12 до 28 нед, наоборот, превышение не достигало нормы в возбудительной последовательности, а в смешанной - исчислялось в пределах нормы.

В заключение, естественным механизмом противодействия нейродегенерации выступает депрессия, которая вначале углубляется, затем спадает. Создается необходимость ее протекторной поддержки с удлинением действия вплоть до восстановления возбудительных эффектов. Представляет интерес тормозный механизм протекции, опосредованный, в частности ГАМК, содействующий восстановлению исходного соотношения синаптических процессов. Углубление депрессорных реакций, очевидно, является следствием выдвижения их в качестве протекторных в начальной стадии восстановления. Согласно собственным данным, депрессорные реакции интенсивнее вовлекаются как при неспецифической, так и специфической нейродегенерации [3, 4, 10 и др.]. Более того, изучения на клеточном и сетевом уровнях доказывают, что синаптическое торможение не может оцениваться лишь в качестве противостоящего возбуждению, а обслуживает высоко специфические функции в нервной системе млекопитающих [1]. Отсутствие выраженной депрессии в настоящем исследовании полагает необходимость привлечения фармакологической интервенции с целью ее усиления.

Correlation of excitatory and depressor synaptic processes in hippocampal, amygdalar and Meynert nucleus neurons in dynamics of
development of Alzheimer’s disease induced by Аβ 25-35

А.V. Vardanyan

In semichronic experiments in intact Albino rats  (n=8) on amyloid model of Alzheimer’s disease
 (AD) (n=15) after 12 -28 weeks activity registration of single  neurons of hippocampus (H) and amygdala (Am) to high frequency stimulation (HFS) of entorhinal cortex (EC), neurons of Am and Meynert nucleus (NM) to HFS of H, by mean of on-line selection and software mathematical analysis based on depressor and excitatory tetanic (TD and TP) and post tetanic (TD PTD and TD PTP) effects, the comparartive analysis of impulse activity of neurons H, Am and NM in norm (n=200) and on the model of AD after 12-28 weeks (n=676) were conducted. On the whole, the activity of 886 neurons were registered: from H (236), Am (319) and NM (258). Tetanic depressor processes in corresponding post tetanic successions in neurons of H with elongation of trials periods were raised, exceed the norm and approaching its, with significant prevail in Am neurons at EC HFS, with relatively low prevail and equalization the norm at H HFS and below and above the norm in NM neurons at H HFS. The excitatory tetanic effects in neurons of H at EC HFS after 12 weeks in both sequences considerably above and below the norm were proved, respectively, after 15-16 and 28 weeks – the exceeding of level below and above the norm in same successions were reached. In neurons of Am at EC HFS after 12 weeks the situation reverse proved – insignificantly and considerably above the norm. In Am and NM neurons at H HFS, on the whole, the changes in unimportant limits were determined. In Am neurons at H HFS the prevail of tetanic potentiation in excitatory sequences, below the norm be up to 12, 13 and 16 weeks of trials, to 18 weeks some exceed it and in mixed – at all time of trials the norm no approach. Finally in NM neurons at H HFS from 12 up to 28 weeks, conversely, the exceeding in excitatory succession the norm are no approached and in mixed – in the limit of norm are calculated. In conclusion, the indicators of counteraction of neurodegeneration, in particular, on the example of deepening of tetanic depression, with elongation of trials periods were raised, exceeded the norm or equated to it.  

Դրդող և արգելակոզ սինապսային պրոցեսների հարաբերությունը հիպոթալամուսի, ամիգդալայի և Մեյներտի կորիզի նեյրոններում Ալցհեյմերի հիվանդության զարգացման դինամիկայում՝ Aβ 25-35-ով առաջացրած մոդելի վրա:

Ա.Վ. Վարդանյան

Ինտակտ Ալբինո առնետների (n=8) և Ալցհեյմերի հիվանդության (ԱՀ) ամիլոդայն մոդելի վրա (n=15) կիսախրոնիկ փորձերում 12-28 շաբաթ անց գրանցվել էն հիպոկամպի (Հ), ամիգդալայի (Ամ) միայնակ նեյրոնների ակտիվության գրանցումը էնտորինալ կեղևի (ԷԿ), Ամ-ի, Մեյներտի կորիզի (Մկ) բարձր հաճաղականության գռգրման (ԲՀԳ) ժամանակ՝ օn line -       ընտրությամբ և ծրագրային մաթեմատիկական վերլուծությամբ, ճնշիչ և արգելակիչ տետանիկ (ՏԴ և ՏՊ) և հետտետանիկ (ՏԴ ՊՏԴ և ՏՊ ՊՏՊ) էֆեկտների հիման վրա, կատարվել է Հ- ի, Ամ-ի, Մկ-ի նեյրոնների (n=200) իմպուլսային ակտիվության համեմատական անալիզ նորմայում և 12-28 շաբաթ անց (n=676) ԱՀ մոդելի վրա: Ընդհանուր առմամբ գրանցված է 886 նեյրոնների ակտիվություն՝ Հ-ից (n=236), Ամ-ից (n=319) և Մկ-ից (n=258): Տետանիկ ճնշման պրոցեսները համապատասխան հետտետանիկ հաջորդականությամբ Հ-ի նեյրոններում ԷԿ-ի ԲՀԳ ժամանակ աճել է ըստ փործարկման ժամկետների երկարացման՝ գերազանցելով նորմային և հավասարվելով նրան, նշանակալի գերազանցելով Ամ-ի նեյրոններում էկ-ի ԲՀ գրգռման, համեմատաբար ցածր գերակշռությամբ նորմայի հետ համեմատած  Հ-ի  ԲՀ-ի գրգռման ժամանակ և ցածր ու բարձր նորմայից ՄԿ-ի նեյրոններում Հ-ի ԲՀ գրգռման ժամանակ: Դրդիչ տետանիկ էֆեկտները Հ-ի նեյրոններում  ԷԿ ԲՀԳ ժամանակ 12 շաբաթ անց երկու հաջորդականություններում լինում են նշանակալի բառծր և նորմայից ցածր, համապատասխանաբար 15-16 և 28 շաբաթ անց գերազանցումը հասնում է նորմայից ցածր և առավել ցածր նորմայի մակարդակից՝ միևնույն հաջորդականությամբ: ԷԿ-ի ԲՀԳ ժամանակ Ամ-ի նեյրոններում 12 շաբաթում եղել է հակառակը՝ նորմայից աննշան բարձր: Հ-ի ԲՀԳ-ն ժամանակ Ամ-ի նեյրոններում տետանիկ պոտենցիացիայի բարձրացումը դրդական հաջորդականությամբ նորմայից ցածր էր 12-13  և 16 շաբաթների փորձարկումների ժամանակ, որոշ չափով գերազանցում էր 18 շաբաթում, իսկ խառնակազմ հաջորդականություններում փորձերի բոլոր ժամանակներում նորմայի չեր հասնում: Վերջապես, Հ-ի ԲՀԳ ժամանակ Մկ-ի նեյրոններում 12-ից  մինչև 28 շաբաթվա ընթացքում ընդհակառակը բարձրացումը նորմայի չեր հասնում դրդող հաջորդականություններում, իսկ խառնակազմում՝ նորմայի սահմաններում: Նեյրոդեգեներացիայի հակազդեցության ցուցանիշները, մասնավորապես, տետանիկ ճնշման խորացման օրինակով, հիմնականում աճում էին փորձարկումների ժամկետների երկարացման դեպքում՝ գերազանցելով նորմային և հավասարվելով նրան:

Литература

1. Birke G., Draguhn A. No Simple Brake – the Complex Functions of Inhibitory. Pharmacopsychiatry 2010. vol. 43, S1, p. 21–31.
2. Earnheart JC, Schweizer C, Crestani F, Iwasato T, Itohara S, Mohler H, Lüscher B. GABAergic control of adult hippocampal neurogenesis in relation to behavior indicative of trait anxiety and depression states. J Neurosci. 2007. vol. 27, № 14, p. 3845-3854.
3. Galoyan A.A., Khalaj N., Hambardzumyan L.E, Manukyan L.P., Meliksetyan I.B.,  Chavushyan V.A., Sarkisian V.H., Sarkissian J.S. Protective еffects of hypothalamic proline-rich peptide and cobra venom Naja Naja Oxiana on dynamics of vestibular compensation following unilateral labyrinthectomy. Neurochem. Res. 2010. vol. 35, p. 1747–1760.
4. Galoyan A.A., Sarkissian J.S., Chavushyan V.A., Meliksetyan I.B, Avagyan Z.E., Poghosyan M.V., Vahradyan H.G., Mkrtchian H.H., Abrahamyan D.O. Neuroprotection by hypothalamic peptide proline-rich peptide-1 in Abeta 25-35 model of Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dement. 2008. Vol. 4, № 5, p. 332-344.
5.  Galvan V., Bredesen D.E. Neurogenesis in the Adult Brain: Implications for Alzheimer’s Disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets 2007. vol. 6, p. 303-310.
6. 6.    Hardy J., Selkoe D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science, 2002. vol. 297, p. 353-356.
7. Lacor, P. N., Buniel, M. C., Furlow, P. W. et al. Abeta oligomer-induced aberrations in synapse composition, shape, and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience 2007. vol. 27, p. 796–807.
8. Lu B., Chang J.H. Regulation of neurogenesis by neurotrophins: implications in hippocampus-dependent memory. Neuron Glia Biology, 2005. vol. 1, p. 1–8.
9. Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Elsevier, Academic Press, 5th ed., 2005. 367 p.
10. Sarkissian J.S, Chavushyan V.A., Meliksetyan I., Poghosyan M., Avakyan Z., Voskanyan A., Mkrtchian H., KamenetskyV., Abrahamyan D. Protective effect of Naja naja oxiana cobra venom in rotenone-induced model of Parkinson’s disease: electrophysiological and histochemical analysis. New Armenian Medical Journal. 2007. vol. 1, p 43-56.
11. Shankar G., Li S, Mehta TH, Garcia-Munoz A, Shepardson NE, Smith I, Brett FM, Farrell MA, Rowan MJ, Lemere CA, Regan CM, Walsh DM, Sabatini BL, Selkoe DJ. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory. Nature Medicine 2008. vol. 14, p. 837–842. 
12. Small D.H. Network dysfunction in Alzheimer’s disease: Does synaptic scaling drive disease progression? Trends in Molecular Medicine 2008. vol. 14, p. 103–108.
13. Tsunashima K, Schwarzer C, Kirchmair E, Sieghart W, Sperk G. GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus III: altered messenger RNA expression in kainic acid-induced epilepsy. Neuroscience. 1997. vol. 80, № 4, p. 1019-1032.
14. Wossink J., Karst H., Mayboroda O., Joels M.  Morphological and functional properties of rat dentate granule cells after adrenalectomy. Neuroscience 2001. vol. 108, № 2, p. 263-272.

Вопросы, ответы, комментарии