Ключевые слова: периодическая болезнь, почечный амилоидоз, иммунный статус, антиген, циркулирующие иммунные комплексы, C-реактивный белок

Введение. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о нарушении иммунного ста­туса организма при периодической болезни (ПБ). В частности, показано, что при ПБ на­блю­дается, с одной стороны, активация агрес­сив­­ных Т-лимфоцитов, с другой – подавление деятельности защитных, нормально действую­щих Т-систем (особенно в период обострения). В некоторых исследованиях выявлено, что в перитонеальных и синовиальных жидкостях больных ПБ существует дефицит ингибитора компонента С5а комплемента, что, по мнению авторов, опосредует возникновение серозитов при ПБ, поскольку ингибитор С5а является мощным противовоспалительным фактором, повышающим секреторную способность эле­мен­тов фагоцитарной системы [2,11].

Все вы­ше­­отмечен­ное дает основание предпо­ло­жить важную роль нарушения статуса иммун­ной сис­темы при ПБ [14]. В литературе очень мало дан­ных относительно качественных и ко­ли­чествен­ных характеристик циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) – одного из по­ка­зателей иммунного статуса организма, в сы­во­ротке крови у больных ПБ [8,25]. В не­ко­то­рых ранних исследованиях, приводятся дан­ные, отражающие лишь количественные изме­не­­ния общей популяции ЦИК в сыворотке кро­ви.

Детальное изучение характеристик ЦИК и идентификация аутоантигенов в их составе могли бы в значительной степени прояснить молекулярные основы нарушения иммунного статуса организма при ПБ.

 

Целью настоящей работы являлось опре­де­ле­ние концентрации крупных и мелких суб­фрак­ций ЦИК, выделенных из сыворотки кро­ви больных ПБ, и идентификация белковых компонентов этих комплексов. Поскольку од­ним из неизбежных осложнений ПБ является по­чеч­ный амилоидоз [24], отмеченные пара­мет­ры были определены у больных ПБ как с ами­лоидозом, так и без него. Полученные по этим двум группам больных средние статисти­чес­кие данные сопоставлены и между собой, и с нормой.

 

Материал и методы. Объектом исследо­ва­ния являлась сыворотка крови больных ПБ и здоровых лиц. Клинический материал был получeн из Клинической больницы N1 им. М. Гераци МЗ РА.

 

Выделение крупных и мелких ЦИК про­во­дили дробным осаждением сыворотки крови, разбавленной в 5 раз 1 М боратным буфером, рН 8.6, соответственно 3.5 и 7% полиэти­лен­гли­­колем (ПЭГ; 6 кДа; Fluka, Щвейцария). Для выделения крупных ЦИК к разбавленной сыворотке добавляли равный объем 7% раст­во­ра ПЭГ в вышеотмеченном буфере. После ин­ку­бации при 4оС в течение 18–20 часов смесь центрифугировали при 3000g 15 минут. Полученный осадок представляет собой круп­ные ЦИК. К надосадочному раствору добав­ля­ли 22% раствор ПЭГ в том же буфере до конечной концентрации 7%, инкубировали при 4оС в течение 18–20 часов и осадок, содержа­щий мелкие ЦИК, отделяли центрифугиро­ва­ни­ем. Концентрацию ЦИК определяли спек­тро­фо­тометрическим методом Digeon et al. [4], предварительно растворив полученныe осадки ЦИК в 0.1 н NaOH, и выражали в единицах оптической плотности при 280 нм (А280).

 

Анализ белкового состава ЦИК проводили электрофорезом (ЭФ) в 7 и 11% полиакри­ла­ми­­дном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДС-Na; Sigma, США) [29]. Получен­ные осадки ЦИК предварительно растворяли в трис-HCl буфере, рН 8.5, до первоначального объема сыворотки, инкубировали в присутст­вии 4% ДC-Na с 10% β-меркаптоэтанолом (БМЭ; Fluka, Швейцария) или без него 2 часа при 380С. По окончании ЭФ определяли мо­ле­кулярную массу основных белковых полос, обнаруживаемых в составе ЦИК. Исполь­зо­ва­ли калибровочную кривую, построенную для белков с известными молекулярными массами (стандартный набор белков Life Tecnologies, США), обработанными идентично ЦИК. Обра­бот­­ку и анализ полученных данных проводили с использованием разработанного нами про­грам­много пакета в интерфейсе Матлаб 5.0 [1].

 

Для идентификации белковых компонентов с молекулярной массой 14 и 22 кДа, обнару­жи­ваемых в составе ЦИК, область в геле, содержащую данный полипептид, вырезали и гомогенизировали в 50мкл 100мМ Nа-фосфат­но­го буфера с 0.9% NaCl. После центрифуги­рова­ния гомогената надосадочный раствор подвергали N-концевому анализу (10–12 ос­тат­­ков) на аминокислотном секвенаторе Applied Biosystems-470A (США). Эта часть ра­боты была проведена на базе лаборатории им­муно­химии отделения биохимии Оксфор­д­ско­го университета (Великобритания). Для того, чтобы определить, в какой из известных бел­ков входит отмеченный полипептид, дан­ные по его N-концевой последовательности под­вергали анализу при использовании онлайн электронной базы данных PROSITE [6].

 

Статистическую обработку проводили по t-кри­терию Стьюдента при использовании компьютерной программы Sigma Plot (Sigma, США).

Результаты. В табл. 1 представлены резуль­таты экспериментов по определению кон­цент­ра­­ции крупных и мелких ЦИК в сыворотке крови у больных ПБ как с амилоидозом, так и без него.

 

Результаты статистической обработки данных, полученных при определении концентрации крупных и мелких ЦИК в крови у больных ПБ

 

Как следует из представленных данных, у больных ПБ без амилоидоза (средний возраст M±( 28±11лет; средняя продолжительность заболевания M±( 20±8лет) наблюдается дос­то­­верное, хотя и незначительное, повышение по сравнению с нормой (средний возраст M±( 31±11лет) концентрации как крупных (в 1.5 раза; р<0.0000000115, t=6.31), так и мелких ЦИК (в 1.15 раза; р<0.0004, t=3.67). Повы­ше­ние обеих субфракций ЦИК наблюдается и при ПБ с амилоидозом (средний возраст M±( 34±11лет; средняя давность заболевания 25±11лет) в 1.75 (р<0.00000007, t=8.2) и в 1.2 раза (р<0.007, t=2.78) соответственно.

 

Сравнительный анализ белкового состава ЦИК показал различие частот распределения белков по молекулярным массам между ЦИК, выделенными из крови больных ПБ с ами­ло­и­до­зом и без него, и ЦИК, выделенными из крови здоровых лиц (рис. 1).

 

Pис. 1.Гистограммы распределения молекулярных масс белков в составе ЦИК,

выделенных из крови больных ПБ (а), ПБ с амилоидозом (б) и здоровых лиц (в).

При построении гистограмм были исключены молекулярные массы, относящиеся к норме;

по оси абсцисс – молекулярная масса, кДа, по оси ординат – частота встречаемости молекулярной массы

 

 

Кроме того, в составе ЦИК, выделенных из кро­ви больных ПБ, были обнаружены два по­ли­пептида с молекулярными массами 14 и 22 кДа (рис. 2), которые не обнаруживались в сос­­таве ЦИК, выделенных из крови здоровых лиц.

 

 

Pис. 2. Электрофореграммы ЦИК, выделенных из крови больных ПБ и здоровых лиц (ЗЛ).

СБ–стандартные белки

 

Для идентификации природы этих полипептидов мы выделили их из геля и определили N-концевую аминокислотную последовательность (10–12 остатков) каждого из них. Далее, основываясь на полученных данных, мы провели соответствующий поиск в базе данных по белкам ProSite и установили, что полипептид с молекулярной массой 14 кДа представляет собой α-цепь гемоглобина, а полипептид с молекулярной массой 22 кДа – субъединицу C-реактивного белка. В табл. 2 представлены результаты этой части экспериментов.

Определение природы полипептидов с молекулярными массами 14 и 22 кДа, обнаруженных в составе ЦИК, изолированных из крови больных ПБ

 

 

Обсуждение. Известно, что ЦИК способны к взаимодействию с компонентами и гумо­раль­но­го, и клеточного иммунитета, оказывая су­ществен­ное воздействие на развитие иммун­ного ответа организма. Уровень ЦИК в сыво­рот­ке крови является одним из показателей им­мун­ного статуса организма, в частности, раз­­ви­тия аутоиммунных реакций. Таким обра­зом, результаты наших экспериментов явля­ют­ся еще одним подтверждением существенной роли аутоиммунных процессов в патогенезе исследуемой патологии. Учитывая тот факт, что даже незначительное повышение концен­тра­ции ЦИК приводит к образованию их тка­не­вых отложений, активации системы компле­мен­та и далее к индукции развития воспали­тель­ных процессов и патологическим повреж­де­ниям тканей [17], резонно предположить, что повышенное содержание ЦИК не только от­ра­жает патогенез ПБ, но и его осложнения по­чечным амилоидозом.

 

Кроме того, показано, что при многих за­­болеваниях, характеризующихся развитием ау­тоиммунных процессов, белковый состав ЦИК достаточно специфичен, а природа анти­ге­нов в составе ЦИК в значительной степени отражает молекулярные этиопатомеханизмы данного заболевания. Сопоставление полу­чен­ных нами данных с результатами предыдущих экспериментов по определению белкового сос­тава ЦИК при других патологических состо­яни­ях организма позволяет рассматривать от­ме­ченный параметр как возможный критерий диагностирования ПБ и дифференциального диаг­ностирования ПБ с почечным амилои­до­зом и без него [3,9,10,12,13,15,16,21,23,27,28,30].

 

Обнаружение нами субъединицы C-ре­актив­ного белка в составе ЦИК, выделенных из крови больных ПБ, в определенной степени отражает развитие при данном заболевании воспалительных процессов, что стимулирует иммунный ответ организма. Как известно, CРБ является белком острой фазы иммунного ответа. Он синтезируется в печени и акти­ви­рует систему комплемента по классическому пу­ти, инициирует реакции опсонизации и фа­го­цитоз, активирует нейтрофилы, моноциты и макрофаги, а также является иммуно­моду­ля­то­ром. У здоровых людей СРБ обнару­жи­ва­ется в крови в концентрации до 15 мг/л. Одна­ко при многих патологических состояниях ор­га­низ­ма, включая и ПБ, уровень этого белка в крови значительно повышается. Интересно, что у больных ПБ степень повышения концен­тра­ции СРБ в крови положительно ассо­циирует со степенью тяжести заболевания [5,7,18,19,22].

 

Что касается обнаружения нами α-цепи гемоглобина в составе ЦИК больных ПБ, то этот факт, представляет несомненный интерес, поскольку показано, что и ген, ответственный за генерацию ПБ, и ген, кодирующий α -цепь гемоглобина, находятся на 16 хромосоме в области 16p13.3-p13.1 [20,26].

 

Литература

 

1. Arakelyan A., Boyajian A., Poghosyan A., Mayilyan K., et al. The application package under MATLAB 5.0 environment for molecular weight analysis of the main protein components of the circulating immune complexes, isolated from the blood of patients with strokes. Proceedings of 9th Annual Confe­ren­ce Electron Microscopy-2000, Yerevan, 2000, p.20-1.
2. Ayesh S.K., Ferne M., Flechner I., Babior B.M., Matzner Y. Partial characterization of a C5a-inhibitor in peritoneal fluid, J. Immunol., 1990 Apr 15; 144 (8), p.3066-70.
3. Bartoloni C., Guidi L., Pili R., Lewis Z.A., Tricerri A., Cursi F. et al. Assay, isolation and characte­riza­tion of circulating immune complex­es from serum of gastrointestinal cancer, stage III and IV me­la­noma and chronic inflammatory bowel dise­ase patients, Oncology, 1993; 50(1), p. 27–33.
4. Digeon M., Laver M., Riza J., Bach J.F. Detec­tion of circulating immune complexes in human aor­ta by simplified assays with polyethylene gly­­col, J. Immunol. Methods, 1977; 16 (2), p. 165-83.
5. Drenth J.P., van der Meer J.W., Kushner I. Unstimulated peripheral blood mononuclear cells from patients with the hyper-IgD syndrome pro­duce cytokines capable of potent induction of C-reactive protein and serum amyloid A in Hep3B cells, J. Immunol., 1996 Jul. 1; 157 (1), p. 400-4.
6. http://www.us.expasy.org/prosite.
7. Korkmaz C., Ozdogan H., Kasapcopur O., Yazici H. Acute phase response in familial Mediterranean fever, Ann. Rheum. Dis., 2002 Jan; 61(1), p. 79-81.
8. Levy M., Ehrenfeld M., Levo Y. et al. Circula­ting immune complexes in recurrent polyseros­itis, J. Rhumatol., 1980, Nov-Dec, 7(6), p. 886-90.
9. Linnanmaki E., Leinonen M., Mattila K., Nieminen M.S., Valtonen V., Saikku P. Chla­my­dia pneumoniae-specific circulating immune complexes in patients with chronic coronary heart disease, Circulation, 1993; 87(4), p.1130–3.
10. Maidment B.W. Jr., Papsidero L.D. Nemoto T., Chu T.M. Recovery of immunologically reacti­ve antibodies and antigens from breast cancer immune complexes by preparative isoelectric focusing, Cancer Res., 1981; 41(3), p. 795–9.
11. Matzner Y., Eisenberg S., Sterenski P., Urieli-Shoval S., Azar X. A C5a/IL-8 inhibitor deficiency in serosal fluids and fibroblast cultures of familial fever patients. In: Familial Mediterranean fever. Sohar E., Gafni J., Pras M. Freund Publishing House Ltd., London and Tel-Aviv 1997, p. 3-10.
12. Maury C.P., Teppo A.M. Demonstration of tissue 90 kDa glycoprotein as antigen in circulating IgG immune complexes in dermatitis herpetiformis and coeliac disease, Lancet, 1984; 2(8408), p. 892–3.
13. Maury C.P., Teppo A.M. Immunological abnor­malities in massive cutaneous hyalinosis, Acta Med. Scand., 1985 217(3), p. 331–5.
14. Melamed I., Cabili S., Zakith V., Spirer Z. The immune regulation in familiam Mediterranean fever (FMF), J. Clin. Lab. Immunol., 1988. Jul; 26(30), p. 125-8.
15. Melsom R.D., Smith P.R., Maini R.N. De­monstra­tion of an unidentified 48 kDa polypeptide in circulating immune complexes in rheumatoid arthritis, Ann. Rheum. Dis., 1987; 46(2), p. 104–108.
16. Nerurkar A.V., Advani S.H., Gothoskar B.P. Cir­cu­lating immune complexes (CIC) in Hodgkin's disease. I. Levels and two-dimen­si­o­nal analysis, Neoplasma, 1989; 36(2), p. 199–204.
17. Nezlin R. A quantitative approach to the deter­mi­nation of antigen in immune complexes, J. Immunol. Methods, 2000; 237(1, 2), p.1-17.
18. Ozen S., Uckan D., Baskin E., Besbas N., Okur H., Saatci U., Bakkaloglu A. Increased neutrop­hil apoptosis during attacks of familial Mediterranean fever, Clin. Exp. Rheumatol., 2001 Sep-Oct;19(5 Suppl 24), S. 68-71.
19. Poland D.C., Drenth J.P., Rabinovitz E., Livneh A., Bijzet J. et al. Specific glycosylation of alpha(1)-acid glycoprotein characterises patients withfamilial Mediterranean fever and obligatory carriers of MEFV, Ann. Rheum. Dis., 2001 Aug; 60(8), p. 777-80.
20. Pras E., Aksentijevich I., Gruberg L., Balow J.E. et al. Mapping of a gene causing familial Mediterranean fever to the short arm of chromosome 16, N. Engl. J. Med., 1992, Jun 4;326(23), p. 1509-13.
21. Procaccia S., Lanzanova D., Caputo D., Ferrante P. et al. Circulating immune complexes in serum and in cerebrospi­nal fluid of patients with multiple sclerosis. Characterization and correlation with the clinical course, Acta Neurol, Scand., 1988, 77(5), p. 373–80.
22. Rengelshausen J., Runzi M., Canbay A., Gerken G., Philipp T. Familial Mediterranean fever. New aspects with respect to molecular genetics and pathogenesis revealed in three case reports, Med. Klin., 1999, Dec 15;94(12), p.685-9.
23. Rodahl E., Iversen O.J. Analysis of circulating immune complexes from patients with ankylosing spondylitis by gel electrophoresis and immunoblotting using antiserum against psoriasis associated retrovirus-like particle, Ann. Rheum. Dis., 1986; 45(11), p. 892–7.
24. Rozenbaum M., Rosner I. The clinical features of Familial Mediterranean Fever of elderly onset, Clin. Exp. Rheumatol., 1994 May-Jun; 12 (3), p. 347-8.
25. Schlesinger M., Vardy P.A. et al. Supressor cell deficiency and elevated circulating immune com­plexes in Familial Mediterranean Fever, Clin. Exp. Rheumatol., 1984 Oct-Dec 2(4), p. 354-5.
26. Shohat M., Bu X., Shohat T., Fischel-Ghodsian N., Magal N., et al. The gene for familial Medi­terra­nean fever in both Armenians and non-Ashkenazi Jews is linked to the alpha-glo­bin complex on 16p: evidence for locus homo­ge­neity, Am. J. Hum. Genet., 1992 Dec; 51(6), p. 1349-54.
27. Tereshchenko S.E., Riazanov S.L., Kotelevtsev Yu.V., et al. Relationship between the detection of circulating antibodies to antigen with a mole­cular weight of 67 kD and the severity of clini­cal manifestations of infectious-allergic myocar­ditis, Kardiologiia, 1991; 31(9), p. 19–20.
28. Wahren M., Ringertz N.R., Pettersson I. IgM and IgG subclass distribution of human anti-Ro/SSA 60 kDa autoantibodies, Scand. J. Immunol., 1994; 39(2), p. 179–82.
29. Weber K. and Osborn M. The reability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis, J. Biol. Chem., 1969; 244(6), p. 4406–12.
30. Zhen Q.Y., Walther S., Sodomann C.P. Small albumin-immunoglobulin complexes in patients with liver disease, Immunology, 1983; 48(4), p. 809–15.