Активирование свободнорадикального окисления липидов как тяжелое осложнение в клинике гипогликемического синдрома у детей малолетнего возраста и экспериментальных животных с моделированной инсулином гипогликемией

Ключевые слова: фосфолипиды, малоновый диальдегид, гипогликемия 

Согласно имеющейся научной информации [13], формирование патогенетических механизмов при различных болезненных состояниях организма во многом обусловлено качественно-количественными расстройствами эндогенного альфа-токоферола (-Т) как основного фактора антирадикальной защиты клетки. Высказанные соображения в равной степени касаются и осложнений, проявляющихся в клинике гипогликемического синдрома (ГС) у детей малолетнего возраста (3мес. – 4 года), значительно участившегося в последнее время, по сообщениям ВОЗ.

Исходя из вышеизложенного, были сформированы цели и ,задачи настоящего исследования в плане проведения специальных наблюдений на уровне мембран эритроцитов (МЭ) крови малолетних детей и экспериментальных белых крыс. Изучение особенностей  нарушения у них интенсивности течения свободнорадикального окисления (СРО) липидов в ферментативной (НАДФ.Н2- зависимой–НЗП) и неферментативной (аскорбат-зависимой–АЗП) системах перекисеобразования [2] в направлении выявления расстройств резистентности эритроцитов  к перекисному гемолизу (РЭПГ) как одному из главных осложнений [1,10,12], развивающихся при ГС, заслуживает особого внимания . Это тем более примечательно и важно при выборе тиосульфата натрия (ТСН) в качестве наиболее эффективного средства антиоксидантного действия [3-7,9,14,15,17,19].

Материал и методы 

Исследования проводили на 81 пробе крови малолетних детей с ГС и 38 белых  беспородных крысах-самцах массой 180-200 г, содержавшихся в ординарных условиях вивариях и голодавших перед началом экспериментов в течение 12 ч. Внутривенное введение инсулина в количестве 15мл/массу тела производили проколом шприца по биссектрисе угла венозного расширения, образованного верхней полой и подключичной венами при крестообразной фиксации белых крыс на станках для мелких животных. Забор крови производили из указанной области через  30 и 60 мин после внутривенной инъекции инсулина.

МЭ выделяли по методу, описанному Лимбер [18]. К 4,5 мл крови прибавляли 0,5 мл 1,5 % раствора оксалата натрия, тщательно перемешивали, центрифугировали 15 мин при 1000 g на рефрижераторной центрифуге К-23. Плазму сливали, осадок (эритроцитарную массу) – дважды промывали изотоническим раствором NaCl с последующим центрифугированием и затем суспендировали в буферном растворе (0,01 М NaHCO3, 0,003 M NaCl) c ЭДТА в соотношении 1:5 и центрифугировали при 12000 g на на рефрижераторной центрифуге К-24 в течение 40 мин. Надосадочную жидкость сливали и осадок дважды промывали буфером без ЭДТА, центрифугировали при 12000 g в течение 30 мин. Процедуру повторяли два раза, последний раз с использованием буфера трис-HCl, рН 7,2.

МЭ переносили в фарфоровую ступку, добавляли 15-20 мл ацетона, содержимое тщательно растирали с помощью пестика и сушили под током холодного воздуха до образования сухого остатка [11]. Экстракцию ФЛ и их количественное определение производили по Фолчу [16]. Фракционирование индивидуальных ФЛ проводили методом одномерной восходящей тонкослойной хроматографии с использованием системы растворителей хлороформ-метанол-аммиак (65:35:5). Экстракты ацетоновых порошков наносили на пластины в трех точках, удаленных от нижнего края пластины на 2 см. Пластины высушивали на воздухе и окрашивали в парах йода. Пятна ФЛ желтого цвета идентифицировали с помощью соответствующих стандартных свидетелей (Sigma). После элюирования подкисленным метанолом элюаты выпаривали досуха и сжигали в среде серной и азотной кислот для минерализации органического фосфора, количественное определение  которого производили по измерению оптической плотности синего окрашивания раствора, развивающегося в результате инкубирования его в присутствии молибденовокислого аммония и витамина С при 37оС в течение 1,5 ч. После охлаждения пробы фотометрировали на СФ-26 при длине волны 830 нм [8].

Результаты и обсуждение

Как показали результаты проведенных исследований, отраженные в табл. 1, в цельной крови малолетних детей с ярко выраженным ГС отме

Таблица 1

Количественное содержание малонового диальдегида  (в нМ/мг белка) в НАДФ.Н_^2- и аскорбатзависимой системах переокисления липидов в цельной крови детей малолетнего  возраста с гипогликемическим синдромом

Примечание. п=81; x – P‹0,001; xx– P‹0,0; без обозначений– расхождения от контроля статистически не достоверны

Таблица 2

Количественное содержание малонового диальдегида  (в нМ/мг белка) в НАДФ.Н_2- и аскорбатзависимой системах переокисления липидов в мембранах эритроцитов крови детей малолетнего  возраста с гипогликемическим синдромом

Примечание. п=81; обозначения те же, что и в табл.1

чается чувствительное активирование СРО липидов. Последнее расценивается как интенсивно совершающийся процесс вовлечения освобождающихся при деацилировании фосфолипидов (ФЛ) под действием фосфолипазы А2 (ФЛазаА2) жирных кислот (ЖК) полиенового ряда в реакции перекисеобразования особенно в АЗП. Аналогичная картина в более выраженной форме прослеживается и в МЭ, как это отражено в табл.2. Отмеченные закономерности были зарегистрированы и в экспериментах на беспородных белых крысах-самцах с моделированной инсулином гипогликемией, согласно данным, приведенным в табл. 3.

Таблица 3

Динамика  изменений количества малонового диальдегида (в нМ/мг белка) в НАДФ.Н_2- и аскорбатзависимой системах переокисления липидов в мембранах эритроцитов крови белых крыс в различные периоды развития гипогликемического синдрома, моделированного инсулином

Примечание. п=81; обозначения те же, что и в табл.1

Примечательно, что по результатам исследований, отраженным в табл. 4, степень эффективности антиоксидантного действия в  опытах in vivo сверхнизких концентраций ТСН является отчетливым отражением ее дозо- и времязависимости. 

Таблица 4

Динамика  изменений количества малонового диальдегида (в нМ/мг белка) в НАДФ.Н_2- и аскорбатзависимой системах переокисления липидов в мембранах эритроцитов крови белых крыс спустя 2ч после однократного внутривенного введения им 1 мл тиосульфата натрия 

10-6М, 10-9М и 10-12М на фоне гипогликемии,  моделированной инсулином

Примечание. п=36; обозначения те же, что и в табл.1

Согласно данным табл. 5, по нашим неоднократным наблюдениям наиболее высокий уровень антиоксидантного действия проявляется при испытании самой низкой концентрации ТСН – 10-12М при 4-часовой ее экспозиции в инкубационной среде трис-НСl  буфера (37оС, рН 7,4). Для исключения возможного побочного действия одного только ТСН в специальной серии исследований на интактных животных были изучены особенности изолированного действия указанных концентраций ТСН. Как оказалось, они не сопровождаются сколько-нибудь заметными статистически достоверными отклонениями интенсивности течения перекисеобразовательного процесса, отчетливо приведенными в табл.6.

Таблица 5

 Динамика  изменений количества малонового диальдегида (в нМ/мг белка) в НАДФ.Н_{2 -} и аскорбатзависимой системах переокисления липидов в мембранах эритроцитов крови белых крыс с 60-минутным инсулинмодулированным гипоксическим синдромом и эффекты (1) 2-  и (2) 4-часовой инкубации их в буферной системе в присутствии сверхнизких доз ТСН

Примечание. п=36; обозначения те же, что и в табл. 1

Таблица 6 

Динамика  изменений количества малонового диальдегида (в нМ/мг белка) в НАДФ.Н_{2 -} и аскорбатзависимой системах переокисления липидов в мембранах эритроцитов крови интактных белых крыс после внутривенного введения им 1 мл тиосульфата натрия в концентрации 10^-6М, 10^-9М и 10^-12М

 Примечание. п=36; без обозначений дозо- и времязависимые расхождения содержания 

                               МДА в обеих системах переокисления  статистически не достоверны

Как вытекает из приведенных результатов, во всех случаях уровень конечного продукта окисления липидов – малонового диальдегида колеблется в пределах контрольных величин, что свидетельствует об отсутствии побочного действия ТСН на стабилизированный в норме уровень перекисей. Являясь мощным синергистом -Т, ТСН оказывает всяческое воздействие на поддержание существующего в физиологических условиях динамического равновесия между про-  и антиоксидантными системами организма. Подтверждением высказанных соображений можно признать результаты последующих серий исследований, отраженные в табл. 6. и посвященные изучению количественных 

Таблица 7

Динамика  изменений количества малонового диальдегида (в нМ/мг белка) в НАДФ.Н2 - и аскорбатзависимой системах переокисления липидов в мембранах эритроцитов крови белых крыс в различные промежутки времени после введения им инсулина на фоне предшествовавшей внутривенной инъекции 1 мл 10-12М тиосульфата натрия

Примечания. п=36; обозначения те же, что и в табл. 6

колебаний МДА в МЭ экспериментальных животных, предварительно инъецированных ТСН перед выработкой у них инсулинзависимого ГС. Как вытекает из данных, приведенных в табл. 7, спустя 30 и особенно 60 мин после инъекции белым крысам инсулина на этом фоне не имеет места развитие характерного для инсулинмоделированного ГС четко проявляющегося активирования СРО липидов  с выходом значительных концентраций МДА, что является показателем развивающегося в условиях действия ТСН стабилизированного статуса антиоксидантной системы эндогенных механизмов антирадикальной защиты клетки и биологических систем организма в целом.

Литература

1. Бдоян O.К., Едоян Л.В., Казарян А.В., Карагезян К.Г. Особенности качественно-количественных изменений фосфолипидов в эритроцитарной массе и мембранах эритроцитов белых крыс с инсулиновой гипогликемией. Мед. наука Армении НАН РА, 2006, т. XLVI,  1, с. 44-47.
2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах/Под ред. Г.М. Франка. М., 1972.
3. Едоян А.Р., Карян Ш.С., Едоян Л.А. и др. Эффекты сочетанного применения сверхмалых доз кальциевого преципитата дрожжевой низкомолекулярной двуспиральной  РНК с тиосульфатом натрия на метаболизм жирных кислот головного мозга белых крыс с аллоксановым диабетом. Мат. VII ежегодной научной сессии Академии  мед. наук Республики Армения. «Современные вопросы сахарного диабета». Ереван, 2003.
4. Едоян А.Р., Овакимян С.С., Амирханян Л.Т. и др. Комбинированная антиоксидантотерапия как эффективный регулятор нарушений тканевых процессов фосфолипидного метаболизма при сахарном диабете в эксперименте. I Всероссийская конференция по иммунотерапии. Сочи, 2003, т.5, 1.
5. Едоян Л.В., Аганянц М.А., Астабатян М.А. и др.  Лазерное облучение сверхнизкой интенсивности при нарушениях гликолипидного обмена у аллоксандиабетических белых крыс. XI Международная конференция по химии органических и элементоорганических пероксидов. Москва, 2003. 
6. Едоян Л.В., Карян Ш.С., Амирханян О.М. и др. Особенности нарушений процессов свободнорадикального окисления липидов в митохондриях аллоксандиабетических белых крыс и пути их эффективного корригирования применением сверхмалых доз Са2+-дс-РНК . I Всероссийская конференция по иммунотерапии. Сочи, 2003, т.5, 1.
7. Едоян А.Р. Специфика корригирующего действия сверхнизких доз факторов химической и физической природы при нарушениях метаболизма фосфолипидов у белых крыс с моделированным аллоксаном сахарным диабетом. Автореф. дис. Ереван, 2004.
8. Зубер В.Л. Методы исследования фосфолипидов. В. кн.: Методы биохимических исследований. Л.,  1982.
9. Казарян А.В. Особенности структурных изменений фосфолипидов головного мозга белых крыс  с  сахарным диабетом, моделированным аллоксаном. Изд. Международной конференции “Ломоносов-2005”, Москва, 2005.
10. Казарян А.В., Овакимян С.С., Секоян Э.С.,  Карагезян К.Г. Особенности антикоагулянтных свойств вновь синтезированных препаратов кумаринового ряда. ДНАН РА, 2006, т. 106, 1, с. 72-79.
11. Карагезян К.Г. Методика качественного и количественного определения фосфолипидов цельной крови, плазмы, сыворотки и цереброспинальной жидкости у собак. Лаб. дело, 1969, 1, с.23-26.
12. Карагезян К.Г., Бдоян О.К., Kазарян А.В., Овакимян С.С. Специфика функциональной активности метаболизма гликогена в биологических системах  белых крыс с сахарным диабетом, моделированным аллоксаном. Мед. наука Армении НАН РА, 2006, т. XLVI, 2, с. 3-7.
13. Мартиросян А.А., Казарян А.В., Секоян Э.С. и др. Специфика корригирующего действия ультрафиолетового облучения при нарушениях резистентности эритроцитов к перекисному гемолизу у белых крыс с сахарным диабетом, моделированным аллоксаном.Аллергология и иммунология, Афины, 2005, т. 6,  3, с. 368.
14. Матинян Г.В. Функциональные изменения печени и лечебное действие тиосульфата натрия при хлоропреновом отравлении. Изв. АН АрмССР, 1959, т.12,  6, с.33-42.
15. Матинян Г.В. Действие хлоропрена и тиосульфата натрия на активность орнититранскарбамилазы и карбамилфосфатсинтетазы. Биол. журн. Армении, 1968, т. 21, 9, с.22-29.
16. Folch J., Lees M., Sloane-Stane G. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem., 1957, 226, p.497-509.
17. Ghazaryan A.V., Hovsepyan L.M., Karageuzyan K.G. Specifities of phospholipids metabolism in rat brain tissue under the conditions of diabet mellitus, modulated by alloxan, Iranian Journal of Biochemistry and Molecular Biology, Iran, 2005, p-31.
18. Limber G.R., Davie R.F., Haker A.M.S. Acrylamide gel electrophoresis studies of human erythrocyte memebrane,  Blood,   1970,  36, 2, p.111-118.
19. Karageuzyan K.G., Ktsoyan Zh.A.,  Ghazaryan A.V.,  Elbakyan G.V.,   Sarkisyan N.N.,  Khachatryan Z.A., Arakelova K.A.,   Manukyan G.P.,  Kazaryan K.A.,  Sedrakyan A.M.,  Hovhanessyan A.I.,  Tatyan M.V. Lysophosphatidilcholines of blood as an possible ethiopathogenic factor at familial mediteranean fever (periodic disease), International J.on Immunoreabilitation, Athens, 2005, 7, 2, p.102. 

Вопросы, ответы, комментарии