Известно, что после сорока происходит уменьшение мышечной массы, и уже к восьмидесяти годам от нее остается одна треть. Данный процесс носит название саркопения. Он является неизбежной стороной старения. Ученые из научного центра Сан-Антонио поясняют причину изменений тем, что в организме снижается уровень защитных антиоксидантов, а повышение окислительного стресса ведет к плохому снабжению клеток энергией и их гибели. Без определенного фермента митохондрии (энергетические станции клеток) перестают нормально работать. Они наоборот удваивают факторы, приводящие к гибели клетки. Снижение работы митохондрии плохо влияет на то, как моторные нейроны заставляют мышцы сокращаться. Подобное взаимодействие происходит в специализированном синапсе, а структура называется нейромышечной передачей. Ученые вывели мышей без нужного антиоксиданта, называемого медно-цинковой супероксидной дисмутазой. Оказалось, что митохондрии у таких грызунов стали работать хуже, что приводило к гибели клеток. Понимая суть саркопении, ученые смогут создать новые лекарства для того, чтобы лечить другие серьезные мышечные заболевания. Источник: Physorg

Ученые из США открыли новый белок — Dab2, который вызывает рак и приводит к миграции злокачественных клеток. Еще раньше исследователи сосредоточились на процессе, получившем название эпителиально-мезенхимальный переход. Именно он дает начало новым опухолям в организме. Большинство опухолей начинается в эпителиальной ткани, покрывающей другие структуры в теле человека. Они обладают маркерами на поверхности клеток, при смещении которых происходит эпителиально-мезенхимальный переход и миграция. Изучая биологию распространения рака, ученые выявили, что преобразование бета-фактора роста (TGF-бета) вызывало формирование Dab2, приводящее к активации перерождения клеток. Оказалось, что TGF-бета, являясь супрессором опухоли, наоборот, помогает росту и метастазированию на поздних стадиях болезни. Отключение Dab2 полностью останавливало эпителиально-мезенхимальный переход. Изучив каскад реакций, связанный с преобразованием маркеров клеток, ученые смогут проектировать новые препараты против рака. Источник: Medicalnewstoday

Ученые из медицинской школы Джона Хопкинса, изучая контроль над делением клеток, обнаружили роль сахара в данном процессе. Ранее неизвестные выключатели сахара теперь могут стать потенциальными целями для препаратов, применяемых для лечения многих заболеваний. Усилия ученых сосредоточены на аппарате, который позволяет клетке человека делиться, сложной биохимической машине, собравшей сотни белков. Обычно считалось, что фосфаты приводят к закреплению и отсоединению белков в процессе, называемом фосфориляцией. Однако в новом исследовании был найден новый элемент, основанный на сахаре белковой модификации под названием O-GlcNAcylation, которая также занята в регулировании фосфориляции. Когда молекула O-GlcNAc располагалась возле участка фосфата, она препятствовала соединению. Белки, вовлеченные в деление клетки, не были фосфорилированы и активизированы без отделения молекулы сахара. Добавляя дополнительный элемент, ученые остановили деление клеточных культур. Это приводило к образованию нескольких ядер в клетке — что свойственно многим раковым клеткам. Открытие позволяет глубже изучить процесс деления клеток и передачи сигналов, которая состоит в том, как клетка реагирует на стимулы внешней среды. Источник: Medical News Today

Лаборатория GeoVax Labs, расположенная в Атланте и работающая над различными вакцинами против заболеваний, вызванных вирусом иммунодефицита человека, объявила о начале новых клинических испытаний. «Предотвращение...

Ученые выяснили одну из причин преждевременного старения человека. Исследователи нашли фрагмент ДНК, изменения которого могут приводить к увеличению биологического возраста (по сравнению с реальным) почти на четыре года. Работа британских специалистов в области молекулярной биологии и медицинской генетики опубликована в журнале Nature Genetics. От ранее появлявшихся сообщений о «генах старения» она отличается важной особенностью: ученые изучали гены на реальных образцах крови 2917 человек, а не исследовали процессы в организме лабораторной мыши. Какие гены старения действительно важны? О причинах старения клеток биологи могут сказать достаточно много. Нобелевская премия 2009 года по медицине и физиологии была вручена именно за работы в этой области: Элизабет Блэкберн, Кэрол Грейдер и Джек Шостак получили почетную награду за открытие так называемых теломер. Теломеры — это своеобразные белковые «заглушки» на концах хромосом. Считается, что они повышают устойчивость ДНК (хромосома — это молекула ДНК и белки) и защищают ее от повреждений, а каждое деление клетки приводит к тому, что теломеры сокращаются. Чем большее число раз клетка поделилась, тем менее надежной стала защита ДНК. Это, в свою очередь, ускоряет накопление ошибок в генах отдельно взятой клетки. Исследователи из Университета Лестера Королевского колледжа Лондона и еще ряда научных и медицинских центров (в числе авторов есть и голландец Герьян Нэвис) изучали именно процесс сокращения теломеров. Точнее, они искали гены, которые могли бы повлиять на этот процесс. Ученые анализировали образцы крови, полученные от разных людей разного возраста и с разным состоянием здоровья. Последнее надо подчеркнуть особо, так как многие биологические и медицинские исследования проводятся на животных, а иногда в качестве объекта ученые выбирают и клеточные культуры. Эксперименты на мышах, крысах и культурах клеток очевидным образом позволяют сделать больше, чем клинические исследования (мышь, можно, например, лишить какого-то определенного гена и посмотреть, что из этого получится), но в них и больше расстояние от научной работы до практического применения результатов открытия. Где? Анализ почти 3 тыс. образцов генетического материала, добытого из лейкоцитов, клеток крови, позволил ученым выявить участок ДНК, ответственный за скорость сокращения теломер. Этот участок исследователи обнаружили рядом с геном TERC, кодирующим один из компонентов теломер. Что это за ген? Ген TERC, как и все прочие гены, несет информацию о молекуле РНК – рибонуклеиновой кислоты). Но если во многих случаях РНК выступает в роли промежуточного переносчика информации от ДНК к рибосомам – внутриклеточным фабрикам по синтезу белка, то TERC кодирует РНК, которая сама по себе работает в составе теломер. Причем именно рядом, а не внутри самого гена: сказать, что ученые нашли именно варианты TERC, было бы неправильно. Согласно оценкам, которые приводит в пресс-релизе Университета Лестера один из авторов работы Тим Спектор, ему и его коллегам удалось найти последовательность, наличие которой позволяет к паспортному возрасту прибавить (для взрослого человека, конечно) от трех до четырех лет. «Впрочем, на фоне неблагоприятных факторов вроде курения, ожирения или грязного воздуха,— говорит Спектор,— эффект будет еще более заметным». Три-четыре года разницы, конечно, не радикальное ускорение (или замедление, если посмотреть с другой стороны) старения. Но, как сообщают исследователи, сокращение теломер может быть связано не только со старением в целом, но и с развитием болезней, поражающих прежде всего пожилых людей.

Необычное открытие сделали биологи: они обнаружили женский половой гормон прогестерон в составе растения. До сих пор считалось, что женские и мужские стероидные гормоны - это прерогатива исключительно животных, пишет cybersecurity.ru. Теперь же половой гормон был обнаружен в составе листьев английского ореха. У животных и людей этот гормон вырабатывается в яичниках и отвечает за подготовку женского организма к внутриутробной беременности, кроме того, он же управляет процессом беременности. Синтетическая версия этого гормона - прогестин, используется для производства противозачаточных средств. По словам Гвидо Паули из Университета Вашингтона, данная находка наводит на мысль о том, что прогестерон - это очень древний биологический регулятор, который мог появиться за миллионы лет до появления животных на нашей планете.

Прорыв в медицинской науке приводит к тому, что возможность использования свиных легких для пересадки человеку становится на шаг ближе. Мельбурнские ученые применили вентилятор и насос для того, чтобы поддерживать донорский...

Разработка новой ткани поможет пациентам восстановить потерянные зубы и дёсны. Известно, что хроническое воспаление десен влечёт за собой потерю зуба и другие разрушения в челюсти. Курение, распространение диабета и генетическая предрасположенность — основные враги здоровых дёсен. За последние годы исследование в Институте Гриффита было сосредоточено на выращивании стволовых клеток и фибробластов дёсен для того, чтобы вернуть красоту улыбки. В предыдущих работах они изучили факторы роста и подобрали нужные типы клеток для восстановления тканей. Теперь они применяют новую технологию для того, чтобы закрепить лоскуты клеточных культур и безопасно соединить их с поверхностью корня зуба. Трансплантация клеток занимает приблизительно шесть месяцев. Источник: News-medical

В университете исследователей Мичигана было доказано, что сила скручивания молекул ДНК нарушает генную экспрессию — процесс, управляющий функционированием клеток. Ученые впервые обратили внимание на действие физических сил в области работы генов. Иногда клетки начинают ошибочно интерпретировать регулирующие сигналы, потому механическая сторона ДНК также приводит к патологиям. Используя «оптические микропинцеты» или лазеры, ученые приложили к концам спиралей ДНК силу по 200 фемтоньютонов (1 фемтоньютон равен 10-15 Ньютона). Она соответствует весу одной биллионной части рисового зерна. Оказалось, что скручивание уменьшилось в десять раз на концах сегментов, прикрепленных к устройству. Именно спиралевидная форма ДНК защищает работу гена. Специализированные белки действуют подобно застежкам, соединяя отдаленные участки ДНК для формирования петли. Эксперимент был проведен на свободной ДНК, но в клетке действуют силы, превышающие заданную учеными в сотни раз. Сейчас ученые занимаются количественными измерениями данного процесса, составляя диаграммы и уравнения. Источник: News-medical

Мозг пациента, находящегося под общим наркозом, отвечает на те же стимулы, что и во время глубокого сна. Данное утверждение делает правдоподобной развивающуюся теорию сознания и предполагает новый метод для оценки потери сознания больных в состоянии комы. Ученые из Медицинской школы Висконсина применяли мидазолам, который используется в качестве седативного средства при колоноскопии. Ученые использовали метод транскраниальной магнитной стимуляции нейронов коры головного мозга и электроэнцефалографию для записи реакций мозга. Таким образом, удалось выявить структуру глубокого сна, связанного с отключением сознания. Хотя мозг фактически был выключен, ученые наблюдали дифференцированные реакции на электрические стимулы, подобные тем, что происходят в фазе быстрого сна или наяву. Во время бодрствования кора участвует во многих видах деятельности, потому происходит сообщение между её различными областями. В бессознательном состоянии такое сообщение невозможно, потому реакции мозга остаются ограниченными. Ученые давно предполагали, что анестезия затрагивает некоторые центры естественного сна. Но потеря функциональных возможностей общения областей мозга в обоих случаях связана с утратой сознания. Подобный тест коры головного мозга способен проверить устойчивость сознания пациента во время операций или в состоянии комы. Источник: ScienceDaily

Новый белок-выключатель запускает апоптоз — процесс гибели раковых клеток. Открытие, сделанное в Университете исследований Мичигана, позволило изучить роль белка RIP в качестве посредника между жизнью и смертью плоскоклеточного рака. Раковые клетки способны избегать процесса запрограммированной смерти (апоптоза). Но процесс, таким образом, может быть активизирован искусственно. Перед тем, как принять решение о смерти, клетка многократно анализирует полученные сигналы. Ученые нашли способ для того, чтобы нарушить связь и обмануть злокачественную клетку. Белок RIP действительно стал коммуникатором между белками FAS и FAK во время выживания. Нормальные клетки в опыте присоединялись к матрице для того, чтобы выжить. Смерть незакрепленной клетки называется аноикисом (anoikis – бездомный). Однако злокачественные клетки могут циркулировать в одиночестве, приводя к метастазам. Ученые изменили часть белка RIP, чтобы определить наиболее важные части. Затем они собираются исследовать его действие на мышах. Источник: Physorg News

Костный мозг является основным источником стволовых клеток, однако его извлечение очень болезненно. Ученые обнаружили, что жировая ткань может стать источником регенеративных клеток, называемых гематопоэтическими или клетками-прародителями. Исследователи из Южной Кореи предполагают на протяжении десяти лет создать альтернативу клеткам костного мозга на их основе. Кроветворные клетки-предшественницы могут стать источником другого вида клеток. В большинстве своем они сосредоточены в костном мозге, но также циркулируют в экстрамедуллярной ткани и периферической крови. В пределах жировой ткани расположены стромально-сосудистые или мезенхимальные клетки — прародители сосудистой и соединительной ткани. Жир, как и костный мозг, является питательной средой для развития стволовых клеток, обладая низкими уровнями кислорода и специальной сосудистой системой. Ученые изучали происхождение стволовых клеток на мышах, используя соматотропин — фактор роста, и ускоряя обмены между костным мозгом и периферической кровью. Тем больше им удалось накопить стволовых клеток в стромально-сосудистых тканях. Клетки на протяжении 16 недель сумели дифференцироваться в другие типы. Источник: ScienceDaily

Ученые из государственного университета Огайо обнаружили путь движения ферментов, восстанавливающих поврежденные на солнце ДНК. Открытие будет способствовать созданию новых методов лечения ожогов. Ультрафиолет повреждает кожу, приводя к формированию химических соединений в неположенных местах вдоль молекул ДНК клеток. Мелкие молекулы под названием фотолиазы обычно залечивают раны. Однако при достаточном разрушении ДНК и гибели клетки появляется солнечный ожог. Фотолиазы сложны в изучении, поскольку их работа продолжается доли секунды. Ученые использовали лазерный луч, чтобы проследить за тем, как ферменты лечат ДНК, без присоединения каких-либо флуоресцентных молекул, мешающих их движению. Ученые смогут воссоздать карту движения ферментов на участке репарации ДНК. С помощью лазерных снимков они обнаружили форму и расположение молекулы, разбивающей вредные химические соединения. В природе ДНК избегает повреждений, преобразовывая солнечные лучи в высокую температуру. Солнцезащитные лосьоны отражают ультрафиолет или рассеивают его. Когда ДНК поглощает солнечную энергию вместо того, чтобы преобразовать ее для нагревания, происходит ожог. Конечно, фотолиазы не восстанавливают ДНК полностью, и со временем накопление мутаций приводит к заболеваниям, таким как рак кожи. Однако изучение полезных ферментов однозначно поможет изобрести лекарства для обгоревшей кожи. Источник: Medical News Today

Американские ученые под руководством Мариуса Вернига из Института биологии стволовых клеток Стэнфордского университета научились получать нервные клетки из других клеток организма, сообщает ТСН. В частности, это удалось сделать в экспериментах с человеческими и мышиными клетками кожи - фибробластами, в которые с помощью специальных подобранных вирусов вносились определенные гены. Традиционно этот процесс проходит через этап образования недифференцированных клеток, которые уже затем дают другие специализированные клетки организма. Теперь же впервые удалось из фибробластов напрямую получить нервные клетки нейроны. В ходе эксперимента ученые направляли жизнь клеток по необычному сценарию, в результате которого они за 32 дня полностью меняли ориентацию. При этом преобразовалось около 20% клеток. Аналогичный эксперимент ученые провели с клетками, взятыми с хвостов мышей. Эффективность опыта в этом случае оказалась такой же, только весь процесс превращения занял неделю. По словам авторов исследования, полученные нейроны устанавливали связи друг с другом и передавали импульсы другим нервным клеткам. Формировались так называемые синапсы - места контакта между двумя нейронами. Как сообщалось ранее, недавно были обнаружены клетки, которые могут формировать новые нейроны коры головного мозга.

Исследователи из университета штата Юта, которые возглавили международную группу ученых, первыми сообщили об обнаружении ранее не описанного свойства тромбоцитов – их способности к воспроизводству в кровотоке. Их, без преувеличения, революционные выводы были опубликованы 19 января 2010 года в журнале Blood. Американские ученые обнаружили способность тромбоцитов к воспроизводству Как известно, тромбоциты развиваются в костном мозге из клеток-предшественников. Это процесс называется тромбопоэзом. На последней стадии тромбопоэза происходит отделение тромбоцитов от цитоплазмы клеток-предшественников и попадание их в кровь. Из-за отсутствия ядер, циркулирующие в кровеносной системе тромбоциты иногда называют цитопластами. Поскольку ДНК клетки находится в ядре, ранее считалось, что тромбоциты неспособны к самовоспроизводству. Тем не менее, новое исследование, проведенное под руководством Хансйорга Шварца (Hansjörg Schwertz) и Эндрю Уэйриха (Andrew S. Weyrich), сотрудников факультета медицины университета штата Юта, США, показало, что тромбоциты способны создавать новые тромбоциты. «Клетки с ядрами обычно при делении разделяются на две дочерних клетки, при этом генетический материал обычно делится на две одинаковых порции, - рассказывает профессор кафедры хирургии доктор Шварц. – Мы обнаружили, что тромбоциты при размножении генерируют два или более дочерних образования, которые соединены между собой, как бусины в ожерелье. При таком способе размножения наличия ядер не требуется». Шварц и его коллеги обнаружили, что образованные в результате описанного процесса тромбоциты отличаются от тех, что образовались обычным способом, структурно и функционально, но при этом имеют такую же форму и размер, как и нормальные. Обмен веществ у тромбоцитов, образованных различными способами, протекает одинаково. Ученые выяснили, что при недостатке уровня тромбоцитов в крови человека таким образом можно возродить их в нужном количестве. Другими словами, это открытие поможет разработать методику лечения для пациентов, у которых из-за проблем со здоровьем уровень тромбоцитов в крови аномально низок. Доклад о проведенной работе был опубликован исследователями неделю назад в журнале Blood.

За возникновение симптомов аллергии отвечают множество различных биохимических реакций и веществ, к которым американские ученые добавили еще одно – белок с кодовым обозначением TSLP. Это открытие может помочь в поисках...

Несколько лет ученые пытаются найти лучший источник стволовых клеток для взрослых людей. В целях перепрограммирования уже использовались клетки кожи, соединительной ткани, костного мозга, крови, волос и зубов. Последние исследования предлагают новый эффективный способ, для которого подойдут "ненужные" и даже в какой-то мере вредные клетки организма, сообщает likar.info. В ходе научно-исследовательской работы удалось обнаружить, что из жировых клеток можно получить индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-cells) быстрее и с большей эффективностью, чем при использовании клеток кожи. Результаты работы дают надежду на быстрое формирование стволовых клеток и их использование, считают ученые. Специалисты пояснили, что из колонии 10 тысяч фибробластов (клетки соединительной ткани) можно выделить лишь одну индуцированную плюрипотентную клетку, на это обычно уходит около месяца. Она, в свою очередь, может стать любой "взрослой" клеткой человеческого организма. Все прочие вариации (источники) пока не превзошли данных результатов. На фоне других выделяются, пожалуй, только кератиноциты (keratinocyte), полученные из крайней плоти младенцев, но этот источник стволовых клеток не подходит для взрослых. Результаты нового исследования дают основания надеяться, что производство стволовых клеток станет более простым, быстрым и дешевым.

Несколько лет ученые пытаются найти лучший источник стволовых клеток для взрослых людей. В целях перепрограммирования уже использовались клетки кожи, соединительной ткани, костного мозга, крови, волос и зубов. Последние исследования предлагают новый эффективный способ, для которого подойдут "ненужные" и даже в какой-то мере вредные клетки организма. В ходе научно-исследовательской работы удалось обнаружить, что из жировых клеток можно получить индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-cells) быстрее и с большей эффективностью, чем при использовании клеток кожи. Результаты работы дают надежду на быстрое формирование стволовых клеток и их использование, считают ученые. Специалисты пояснили, что из колонии 10 тысяч фибробластов (клетки соединительной ткани) можно выделить лишь одну индуцированную плюрипотентную клетку, на это обычно уходит около месяца. Она, в свою очередь, может стать любой "взрослой" клеткой человеческого организма. Все прочие вариации (источники) пока не превзошли данных результатов. На фоне других выделяются, пожалуй, только кератиноциты (keratinocyte), полученные из крайней плоти младенцев, но этот источник стволовых клеток не подходит для взрослых. Результаты нового исследования дают основания надеяться, что производство стволовых клеток станет более простым, быстрым и дешевым.

Британские ученые создали искусственный желудок, который позволит им более предметно заняться изучением процессов пищеварения у людей. На создание аппарата переваривания пищи, сконструированного специалистами Научно-исследовательского института продовольствия в графстве Норфолк (Англия), ушло около 10 лет, пишет eurolab.ua. Его разработчики полагают, что новое изобретение найдет также широкое применение в фармацевтической отрасли, так как с его помощью можно будет наблюдать за тем, как система пищеварения усваивает тот или иной медицинский препарат, и какие побочные эффекты возникают при этом в желудке. Новый аппарат, как надеются ученые из Норфолка, станет хорошим подспорьем и в изучении различных желудочных заболеваний, включая гастрит. В довершение ко всему, как отметили создатели искусственного желудка, в случае успешного его применения в указанных областях, исследователи смогут отказаться от проведения целого ряда опытов над животными. "Многие воспринимают желудок как "мешок", заполненный жидкостями и ферментами, но это - очень сложный орган, и созданный аппарат точно воспроизводит происходящие в нем процессы,- заявил Мартин Стокс, представитель компании "Плант биосайенсис", представляющей этот прибор на рынке.- Первоначально он разрабатывался для специалистов в области изучения продовольствия для отслеживания того, как человеческий желудок переваривает пищу. Но гораздо большую значимость, как оказалось, он имеет для фармацевтической отрасли для исследования того, как действуют в желудке различные дозы и смеси медицинских препаратов. Это, без всякого сомнения, первый в мире аппарат подобного рода".

Ученые разработали новый способ борьбы с одноклеточными паразитами, вызывающими опасные болезни. Расшифровка строения одного из белков простейших животных позволит создать лекарство, которое убивает паразитов и при этом не влияет на клетки человека. Сонная болезнь, лейшманиоз и болезнь Шагаса вызываются вовсе не бактериями или вирусами. Их возбудители относятся к одноклеточным животным, которые размножаются в организме человека, попав туда через кровь при укусе комара (как малярия), клопов или при расчесывании кожи. Для тропических стран эти болезни являются серьезной проблемой: только в Мексике малоизвестной европейцу болезнью Шагаса в 2005 году было заражено 1,8 млн человек, то есть чуть меньше 2% всего населения страны. И хотя взрослый человек десятки лет может без видимых признаков заболевания являться носителем паразитов, детям заражение угрожает смертельным исходом. Уничтожение Исследование, проведенное в Вандербильдском университете при участии адъюнкт-профессора биохимии Галины Лепешевой, позволило установить структуру белка, необходимого трипаносомам для поддержания их жизнедеятельности. Как говорится в аннотации к статье, опубликованной учеными в журнале Journal of Biological Chemistry, белок с кодовым обозначением 14DM нужен паразитам для синтеза стирольных соединений, к которым относится как холестерин, так и многие гормоны, а также компоненты клеточных мембран: без них клетка жить не может. Ученые, выделившие чистый белок из клеток паразита, заморозили его и просветили полученный белковый кристалл рентгеновским излучением. По рассеянию рентгеновских лучей экспериментаторам удалось реконструировать и форму молекулы, причем с очень высокой точностью – до 1,9 ангстрема. Иными словами, на созданной исследователями трехмерной модели белковой молекулы видны все детали, размер которых превышает одну пятимиллионную долю миллиметра (это лишь втрое меньше диаметра атома углерода – 0,7 ангстрема). Зачем нужна такая точность? Чем выше качество полученной модели, тем проще рассчитать взаимодействие с ней других молекул – примерно так же для изготовления ключа к замку необходимо иметь возможно более точные чертежи. Более того, наряду с простой моделью белка ученые получили модель белка, связанного с молекулой лекарства и призванного блокировать этот важный для паразита белок. Сопоставление простой и заблокированной моделей показало, что для трипаносом и родственных им паразитов ключевой белок действительно может быть заблокирован препаратом, который при этом обладает достаточной избирательностью. А это если и не готовое лекарство, то как минимум прототип его. По крайней мере, в своей статье исследователи характеризуют его как «отличную возможность для целенаправленного синтеза лекарств». О паразитах реальных и мнимых Характерная для ряда псевдомедицинских источников склонность обвинять паразитов почти во всех болезнях практически не имеет под собой реальной почвы, по крайней мере в умеренных широтах. А тезис «паразиты повсюду» чаще всего и вовсе относится к тропическим странам, причем речь идет об одноклеточных организмах, а не о пугающих читателей гельминтах в десятки сантиметров длиной. Радикальные способы борьбы с такими болезнями тоже отличны от приема биологически активных добавок или использования якобы убивающих паразитов приборов. Согласно данным ВОЗ, снизить заболеваемость в странах Африки и Латинской Америки помогли как простые санитарные меры (вплоть до сплющивания пустых жестянок, чтобы в них потом не размножались личинки комаров), так и разработка новых лекарственных средств.